实验二 不同养分水平的溶液培养与植株中养分含量的速测
（综合性实验）
一． 原理
绿色植物在整个生活周期中，除了通过叶片的光合作用外，只要满足正常生长发育所需的各种矿质元素和其他条件，植物不一定非在土壤中生长不可。因此，在用蒸馏水及必需的几种元素配成的溶液中，植物同样可以正常生长发育，这种培养方法称为溶液培养（又称水培）。由于溶液培养其元素的种类和数量可以控制，因此要了解某种元素的数量对植物生长发育的影响时，可有意识地配制不同水平某种元素的培养液，根据植物的生长发育情况及症状，了解其影响。收获后，通过测定植株中的养分含量，了解养分在植物体中的累积情况。
二． 材料、仪器及药品
1、 材料准备
玉米或白菜幼苗于实验前15天左右砂培育苗。
2、 仪器
气泵、天平、pH计、分光光度计、火焰光度计
10ml刻度吸管、1000ml量筒、培养箱及泡沫板、移液器、棉花、试剂瓶、容量瓶、白瓷板、标准滴唧、比色管
3、药品
(1)Ca(NO3)2?4H2O, (2)KNO3, (3 )KH2PO4, (4) K2SO4, (5) CaCl2, (6) NaH2PO4, (7) NH4NO3, (8) KCl (9) FeSO4?7H2O, (10) EDTA-Na2, (11) H3BO3, (12) CuSO4?5H2O, (13) MnSO4?4H2O, (14) ZnSO4?7H2O, (15)(NH4)6Mo7O24?4H2O。（16）MgSO4?7H2O
4、试剂
（1） 浸提剂：称取化学纯氯化钠58.5克放入烧杯中，加入约500毫升蒸馏水溶解，用小量筒准确量取2.1毫升浓盐酸倒入烧杯中，搅匀，移入量筒中，用蒸馏水稀释至1000毫升。
（2） 混合标准原液
用分析天平准确称取分析纯的下列试剂于小烧杯中：磷酸二氢钾0.2194克，硝酸钾1.806克，硫酸钾3.873克，用少量蒸馏水溶解，然后转移至500毫升容量瓶中，用少量蒸馏水洗烧杯几次，都无损地移入量瓶中，最后用蒸馏水稀至刻度，摇匀，即得含磷100mg?L-1，含硝态氮500mg?L-1，含钾5000mg?L-1的混合标准原液。此液加甲苯防腐剂5滴，即可保存3～4个月。
（3） 甲种混合标准稀溶液
用移液管准确吸取混合标准原液1毫升，放入100毫升容量瓶中。用浸提剂稀释至刻度，充分摇匀（勿溅出）即得含磷（P）1mg?L-1，含硝态氮（NO3－N）5mg?L-1，含钾（K）50mg?L-1的甲种混合标准稀溶液。此液几天内失效。
（4） 乙种混合标准稀溶液
用移液管准确吸取混合标准原液2毫升，放入100毫升容量瓶中。用浸提剂稀释至刻度，充分摇匀（勿溅出）即得含磷（P）2mg?L-1，含硝态氮（NO3－N）10mg?L-1，含钾（K）100mg?L-1的乙种混合标准稀溶液。此液几天内失效。
（5） 硝酸试粉：（甲）称取硫酸钡（BaSO4）10克（在105℃下烘干4小时，冷后磨细，过60目筛；这种试剂含硝酸盐的可能性最大，要注意选择），把它分为三份，再称硫酸锰（MnSO4?H2O）1克（磨细，不用过筛），对氨基苯磺酸0.4克，α－萘胺0.2克，分别与一份硫酸钡混合均匀，最后合起来再加入柠檬酸7.5克，一起在研钵中研磨均匀，贮于密闭瓶中。（乙）称取0.2克锌粉（磨细过80～100目筛）及化学纯硫酸钾9.8克，在研钵中充分研细，贮于密闭瓶中。
在整个操作过程中避免与NO3-或NO2-的化合物接触，而且由于柠檬酸吸湿性强，不宜操作过久，以免长期暴露于空气中。
在测定硝态氮时，各加一小耳勺。
（6）0.1%碘液
首先配制1％碘――碘化钾原液：称取2.5克碘化钾溶于50毫升蒸馏水中，待溶解完毕，再加0.5克碘进去，使之溶解，即成为1％碘――碘化钾原液。贮于棕色瓶中，使用前将1％碘――碘化钾原液10毫升加90毫升水即成0.1%碘液。
（7）3.6％钼酸铵盐酸溶液：称取3.6克钼酸铵溶于20毫升水中，另取一烧杯盛53.3毫升浓盐酸（比重1.19）加水10毫升，然后将钼酸铵溶液徐徐加入盐酸溶液中，不断搅拌至澄清，最后用水稀释至100毫升。
（8）盐酸c(HCl)=1.2mol?L-1：用10毫升小量筒准确量取9毫升蒸馏水于干燥的小烧杯中，准确加入1毫升浓盐酸（比重1.19）摇匀。
（9） 锡棒，用化学纯锡粒熔融制成。
（10）0.18%氯化亚锡甘油溶液：用分析天平称取0.018克，没有变质的，透明无色结晶的氯化亚锡（SnCl2?2H2O）溶于1毫升浓盐酸中（比重1.19）加9毫升化学纯甘油，摇匀，密封贮于棕色瓶中备用。此液有效期约半年左右。
（11）盐酸c(HCl)=0.5mol?L-1：吸取4.2毫升浓盐酸，用蒸馏水稀释至100毫升。
（12）5%亚硝酸钴钠溶液：称取亚硝酸钴钠5克与亚硝酸钴钠30克，溶于60毫升水中，加冰醋酸5毫升，定容至100毫升。配好后开盖放置1—2天，逸尽有毒的二氧化氮气体后储于棕色瓶中。此液为母液，用时取5毫升与15%亚硝酸钠液100毫升混合，成工作液。
（13）95%乙醇。
三． 实验处理设计
分3个组完成整个实验。
第1组：处理一：不加氮+其它养分（以—N表示）
处理二：加1/2剂量氮+其它养分（以1/2N表示）
处理三：加1剂量氮+其它养分（以1N表示）
第2组：处理一：不加磷+其它养分（以—P表示）
处理二：加1/2剂量磷+其它养分（以1/2P表示）
处理三：加1剂量磷+其它养分（以1P表示）
第3组：处理一：不加钾+其它养分（以—K表示）
处理二：加1/2剂量钾+其它养分（以1/2K表示）
处理三：加1剂量钾+其它养分（以1K表示）
各处理均为3次重复。
四． 实验过程
(一) 不同养分水平的溶液培养
1． 培养液的配制
先测量培养箱的容积，确定培养液的用量，按表1和表2依次加入各种化合物，注意每加入一种化合物后都要使之溶解，再加下一种，加完全部化合物后进一步搅拌均匀，配成实验培养液。
2． 移苗定植
选取生长一致的植物幼苗作实验材料，每个培养箱定植6株，首先小心将幼苗根部用水冲洗干净，记录幼苗的鲜苗质量（克），然后把幼苗固定在泡沫板上。
3． 培养管理及观察
实验开始后，要认真作好管理和观察记录，每天观察一次，观察植株的长势、叶部的叶色、叶尖叶缘叶脉间的情况；及时补加蒸馏水，维持培养液水平；并及时通过气泵向培养液中补充氧气，每天通气2小时，上下午各1个小时；每星期测定一次pH值，并调节pH值至5.5~6.5。
表1 大量营养元素部分
化合物名称 各处理培养液中的化合物含量：mg/L（括号里为各营养元素含量：mmol/L）
—N 1/2N 1N —P 1/2P 1P —K 1/2K 1K
Ca(NO3)2?4H2O
0 0 472
(N 4.0,
Ca 2.0) 472
(N 4.0,
Ca 2.0) 472
(N 4.0,
Ca 2.0) 472
(N 4.0,
Ca 2.0) 472
(N 4.0,
Ca 2.0) 472
(N 4.0,
Ca 2.0) 472
(N 4.0,
Ca 2.0)
CaCl2 222
（Ca 2.0） 0 0 0 0 0 0 0 0
KNO3 0 404
(N 4.0,
K 4.0) 404
(N 4.0,
K 4.0) 404
(N 4.0,
K 4.0) 404
(N 4.0,
K 4.0) 404
(N 4.0,
K 4.0) 0 242
(N 2.4,
K 2.4) 404
(N 4.0,
K 4.0)
NH4NO3 0 0 0 0 0 0 160
(N 4.0) 65.0
(N 1.6) 0
KH2PO4 100
（K 0.74，P 0.74） 100
（K 0.74，P 0.74） 100
（K 0.74，P 0.74） 0 50
（K 0.36，P 0.36） 100
（K 0.74，P 0.74） 0 0 100
（K 0.74，P 0.74）
KCl 298
（K 4.0，） 0 0 54.8
(K 0.74) 27.4
(K 0.36) 0 0 0 0
NaH2PO4 0 0 0 0 0 0 114.6
(P 0.74) 114.6
(P 0.74) 0
MgSO4?7H2O 246
(Mg 1.0
S 1.0) 246
(Mg 1.0
S 1.0) 246
(Mg 1.0
S 1.0) 246
(Mg 1.0
S 1.0) 246
(Mg 1.0
S 1.0) 246
(Mg 1.0
S 1.0) 246
(Mg 1.0
S 1.0) 246
(Mg 1.0
S 1.0) 246
(Mg 1.0
S 1.0)
表2 微量营养元素部分
化合物名称 每升水含化合物毫克数
（化合物mg/L） 每升水含元素毫克数
（元素mg/L）
FeSO4?7H2O+Na2EDTA 27.8+25 5.6
H3BO3 2.86 0.5
MnSO4?4H2O 2.13 0.5
ZnSO4?7H2O 0.22 0.05
CuSO4?5H2O 0.08 0.02
(NH4)6Mo7O24?4H2O 0.02 0.01
4． 收获及测定植物体内的养分含量
植物培养大约要持续4周左右，收获后，取植株的敏感部位进行养分测定。
（二）植株中养分含量的速测
1． 作物样品的采集
（1）采样要有代表性
进行作物化学诊断，只能选取一定数量来测定，用以反映一块田或一片田的作物生长情况。因此选取测定的作物必须是具有代表性的、一定数量的样品。采样时应先在田头观察作物的生长情况，如长势长相比较均匀一致，一般随机多点采取10～20株样品；如不一致的，取样的数量就应增多。
（2）采样要取敏感部位
取整株作物进行分析是没有必要的。因为作物的各种组织和器官内，含有的营养成分和数量有很大差异；即使是同一种器官，在不同的生育期中，其养分含量也会不同。经过大量实践证明，宜选取作物的敏感部位进行测定。
什么叫敏感部位呢？植株中最能灵敏反映被诊元素丰缺程度的部位，称为敏感部位。例如，我们对氮、磷、钾等可移动元素的测定，一般认为用幼叶是测不出差别来的，因为土壤中这些元素虽然缺乏，但作物本身首先保证幼叶的需要，把这些元素从老叶移动到幼叶中来。而老叶则不同，当这些元素供应不充足时，其中的含量就会迅速下降。因此，我们选择敏感部位进行测定，不同作物的敏感部位如下：
水稻：诊断氮素营养水平（淀粉－碘试法）用心叶往下数第二片叶的叶鞘；诊断磷，钾营养水平用整株的叶鞘。
小麦：诊断氮、磷、钾水平都用心叶往下数第三至四片叶中脉下半段。
玉米：幼苗用整株的叶鞘下半段；抽雄后用果穗对应的叶片中脉下半段。
叶柄明显的作物（如番茄、木薯、马铃薯、油菜、番薯、桑树等），诊断氮、磷、钾营养水平都用中部叶片的叶柄。如作物有10片叶时，取心叶往下数第5～6片叶的叶柄；如作物有6片叶，则取心叶往下数第3～4片叶的叶柄。如此类推。
（3）采样时间
作物体内的养分含量在一天之内变化很大。以硝态氮为例，清晨作物体内游离的硝态氮较多，这是因为硝态氮还原同化过程中，需要阳光和碳水化合物作为能源。因此一般认为硝态氮测定的灵敏时间在清晨。其它养分的变化虽不及硝态氮，但一般也以上午采样较适宜。当然，互相比较的样品必须在同一时间内采集，否则就失去比较的意义。
（4） 采样时期
采样诊断也要注意到不同的生育期。因为作物体内养分的含量会随生育期而变化。一般生育初期体内养分会高于生育中、后期，这样，不同生育期的养分分级标准就有异，不应拿早期分级标准套到中后期去应用，所以采样时应注明生育期，以供研究参考。
2． 作物样品的处理与作物养分待测液的制备
（1）作物样品的处理方法
进行作物诊断的样品，一般要求在田间测定。如不在田间测定，则要尽快带回室内，带回室内用的样品要注意防止水分蒸发所造成的误差。小株作物如水稻，可将其根放在盛少量水的塑料袋中并扎紧袋口；株型大的作物可采取特定的敏感部位样品用湿布包好。采回的样品应立即测定，一般在采样后2小时内完成，否则作物死亡过程中，有部分有机物会分解而造成误差。特别是测定无机磷，一定要用新鲜样品，因为有机磷在植物死亡过程中会迅速矿质化。
（2）作物养分待测液的制备
样品经上述处理后，用干净剪刀将数株作物样品特定部位剪下剪成小段，在研钵中磨烂，然后用角匙把原汁液压出备用。
测定硝态氮和磷是用稀释了的植物汁液进行测定；测定钾是用原汁液测定。
3．旱作物组织中硝态氮的测定
作物吸收氨态氮后会迅速同化，因此正常的作物体内测不出氨态氮。硝态氮虽也会迅速同化，但仍有一部分存在于作物输导系统的汁液中，因此除水稻和木本植物等以外，一般可以检测出一定量的硝态氮。其浓度在一定范围内可反映当时土壤供氮状况及作物体内的氮素营养水平。
测定硝态氮的方法有多种，其中以硝酸试粉法较为方便。
（1） 方法原理
作物汁液硝态氮在0.5~20mol?L-1范围内，在酸性条件(pH5左右)下，与硝酸试粉作用产生红色，按红色深浅可显示硝态氮浓度，与标准色阶比较，即可确定作物汁液中硝态氮含量。
锌在酸性条件下产生氢气，将硝酸根还原为亚硝酸根，然后与对氨基苯磺酸和?－萘氨作用，形成红色偶氮染料。反应如下：
NO3-+Zn+C6H8O7 NO2-+Zn2++C6H6O7-+H2O
(柠檬酸) （柠檬酸根）
NH2 N====N
＋ ＋NO2－＋2H＋ +H2O
SO3H NH2 SO3H NH2
(对氨基笨磺酸) （а－萘胺） （红色偶氮染料）
（2） 测定方法
用标准吸管按表3规定的滴数分别滴入白瓷板中，甲种混合标准液含硝态氮5mg?L-1，乙种标准液含硝态氮10mg?L-1，以浸提剂作稀释液，这样便配制成硝态氮的系列标准液。
取清洁干燥刻度试管一支，用标准吸滴管吸取作物原汁液1滴放入试管中，然后准确地加入浸提剂定容至5ml摇匀，此时原汁液已稀释100倍。此待测溶液供测定硝态氮和磷使用。在白瓷板的另一孔穴中用标准吸滴管滴入已稀释的作物待测液10滴，在待测液和硝态氮系列标准液的每个孔穴中，分别加入硝酸试粉甲、乙两种各一耳勺，用小玻棒搅动10秒钟，静置5分钟后待测液与标准色阶比色，判定待测液硝态氮的浓度。做两次重复。
4． 作物组织中磷的测定
作物根系自土壤吸收的磷素主要是无机磷酸盐，其中约50％的无机磷进入作物体内后迅
表3 硝态氮标准色阶配制及含量换算
孔穴编号 各穴加入甲种混合标准稀溶液的滴数 各穴加入乙种混合标准稀溶液的滴数 各穴加入浸提剂的滴数 标准色阶的硝态氮含量(mg?L-1) 换算成作物汁液的硝态氮含量及分级标准
含量 分级标准
1 1 0 9 0．5 50 缺乏
2 3 0 7 1．5 150
3 5 0 5 2．5 250 中等
4 10 0 0 5．0 500
5 0 7 3 7．0 700 充足
6 0 10 0 10．0 1000
速转化为有机磷，参与新细胞的组成，但其余的50％左右仍维持水溶性状态。这部分水溶性磷的含量可作为作物磷素营养水平的指标。
（1） 方法原理 作物汁液中的无机磷酸盐与钼酸铵作用，生成磷钼杂多酸，在一定酸度范围内，磷钼杂多酸被金属锡或氯化亚锡还原为蓝色的磷钼蓝络合物。溶液蓝色的深浅与含磷量成正比。将待测液的颜色与标准色阶比较，计算作物汁液的含磷量。
（2） 测定方法
用标准吸滴管按表4规定的滴数分别滴入白瓷板中，甲种混合标准液含磷1mg?L-1，乙种混合标准液含磷2mg?L-1,以浸提剂作稀释液，这样便配制成磷的系列标准液。
表4 磷标准色阶配制及含量换算表
编号 各穴加入甲种混合标准稀溶液的滴数 各穴加入乙种混合标准稀溶液的滴数 各穴加入浸提剂的滴数 标准色阶的含磷量（P）量(mg?L-1) 换算成作物汁液磷（P）含量(mg?L-1) 分级标准
1 1 0 9 0.1 10 缺乏
2 3 0 7 0.3 30
3 5 0 5 0.5 50 中等
4 7 0 3 0.7 70
5 10 0 0 1.0 100 充足
6 0 7 3 1.4 140
7 0 9 1 1.8 180
取作物磷素待测液（与测定硝态氮同）10滴放入白瓷板的另一孔穴中，分别在每个孔穴中加入钼酸铵盐酸溶液1滴，盐酸溶液(c(HCl)=1.2 mol?L-1)1滴，用洁净锡棒研磨10秒钟，显色后在5～14分钟内与标准色阶比色，判定作物汁液磷的浓度。做两次重复。
5． 作物组织中钾的测定
作物组织中钾有98％是水溶性的，存在于作物组织中，它的含量变化对土壤钾素供应状况极为敏感，因此可以做为作物钾素测定的指标。测定作物汁液中含钾量的方法有多种，现介绍亚硝酸钴钠比浊法：
（1） 方法原理
浸提液中钾与亚硝酸钴钠作用生成亚硝酸钴钠钾黄色沉淀，加乙醇使沉淀溶解度降低而析出，黄色沉淀多少与钾浓度成正比。
（2） 测定方法
用标准吸滴管按表5规定的滴数分别滴入比色管中，乙种混合标准液含钾100mg?L-1，这样便配制成钾的标准色阶。
在比色管中加2 ml亚硝酸钴钠稀释液，滴入1滴组织汁液，摇匀，再加入乙醇1 ml，摇匀，15分钟后与标准色阶比色。做两次重复。按下式计算结果：
汁液含钾量（mg?L-1）= 读得钾（K）mg?L-1×40（亚硝酸钴钠液体积/取用汁液体积）
表5 标准钾系列配比
标准钾液（mg?L-1） 0 5 10 15 20 25 30
乙种混合标准稀溶液（滴） 0 2 4 6 8 10 12
亚硝酸钴钠液（滴） 40 38 36 34 32 30 28
乙醇（mL） 1 mL 1 mL 1 mL 1 mL 1 mL 1 mL 1 mL
表6 钾诊断参考指标
钾营养状况 充足 中等 缺乏
汁液中钾浓度（mg?L-1） 1000 500—700 200—500
五、实验报告（按撰写论文的格式）
包括前言、材料与方法、结果与分析、讨论等几个方面。
其中起码应包含以下内容：
1、 列出培养液的配制量及所称取的盐类质量。
2、 培养实验结束时，将作物在各种养分水平条件下出现的情况详细进行描述（以1剂量处理作对比，内容包括植株长势，叶部的叶色、叶尖、叶缘、叶脉间的情况，根系的情况等）。并在培养结束时，测定各处理植株的鲜重，作物体内的氮磷钾含量，用图表作出比较，并分析其原因。
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