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乙型肝炎病毒耐药专家委员会 经国家食品药品监督管理局（SFDA）批准用于抗乙型肝炎病毒（HBV）治疗的核苷（酸）类似物有拉米夫定（LAM）、阿德福韦酯（ADV）、恩替卡韦（ETV）和替比夫定（LdT）。核苷（酸）类似物已成为继干扰素α（IFN α）之后的又一类用于抗HBV治疗的有效药物。大多数接受核苷（酸）类似物治疗的患者难以在短期内实现持久应答，必须接受长期治疗，这必将增加抗病毒耐药的发生风险，随着核苷（酸）类似物种类的增加，HBV耐药变异的复杂性也将大大增加。因此，迫切需要对HBV耐药变异的相关概念和命名方法、耐药变异的检测方法以及耐药变异发生后的临床处理等问题进行规范化，以便于学术交流，提高临床诊治水平。为此，《中华实验和临床感染病杂志》（电子版）编辑部组织全国感染病学及肝病学领域知名专家在循证医学原则指导下，对目前临床试验研究结果综合分析的基础上，就上述问题进行了讨论，达成以下共识。 一、乙型肝炎病毒耐药的病毒学基础 HBV属于嗜肝DNA病毒科（hepadnaviridae），基因组长约3.2 kb，是部分双链环状DNA结构。HBV基因组含有4个部分重叠的开放读框（ORF），即前-S/S区、前-C/C区、P区和X区。前-S/S区编码大蛋白（前-S1 + 前-S2 + S）、中蛋白（前-S2 + S）、主蛋白（S），前-C/C区编码HBeAg和HBcAg，P区编码聚合酶/逆转录酶，X区编码HBxAg。不同患者血清中的HBV基因序列存在差异，根据HBsAg蛋白质一级结构和抗原性的不同，HBV可分成不同的血清型，如ayw、ayr、adr和adw等；根据HBV全基因序列差异 ≥ 8%或S区基因序列差异 ≥ 4%，HBV可分成A～H基因型，各基因型又可分成若干个基因亚型。同一患者体内不同的HBV株基因序列之间也存在差别，但在遗传学上高度相关；因此，每一个患者体内的病毒都是由存在基因序列差异的病毒株组成的病毒群，优势和劣势群是相对的，并始终处在不断的变化之中，因此，HBV的病毒群符合准种（quasispecies）的特点。 HBV侵入人体后，与靶细胞膜上的受体结合，脱去包膜，穿入细胞质中，脱去外壳，部分双链环状HBV DNA进入靶细胞核中，在DNA聚合酶作用下，以负链DNA为模板，延长正链，修补裂隙区，形成共价闭合环状DNA（ccc DNA）。HBV DNA的复制首先以ccc DNA为模板，在RNA聚合酶的作用下，转录成3.5 kb、2.4 kb、2.1 kb和0.7 kb等大小不同的HBV mRNA，部分3.5 kb的HBV mRNA属于前基因组RNA，含有HBV的全部遗传信息，在HBV逆转录酶的作用下，合成负链DNA，以此为模板，在DNA聚合酶的作用下合成正链DNA，形成子代病毒的部分双链HBV DNA。其他的HBV mRNA在细胞浆中翻译成病毒的各种蛋白成分，并与子代HBV DNA装配成完整病毒颗粒，释放至细胞外。部分子代HBV DNA，进入靶细胞核中，形成ccc DNA，并继续复制，周而复始。慢性HBV感染者肝细胞核中的ccc DNA半寿期长，很难从体内完全清除。 HBV的复制速度很快，据推算，HBV每24 h可复制1012～1013拷贝。HBV虽然属于DNA病毒，但其复制过程并非DNA-DNA的直接复制过程，而是经过前基因组RNA的中间过程，即DNA-RNA-DNA的复制过程。前基因组RNA逆转录为负链DNA的过程中，HBV逆转录酶由于缺乏严格的校正机制，易致逆转录过程中核苷酸的错配。HBV复制的错配比率介于其他DNA病毒和RNA病毒之间，大约为1/105。因此，HBV复制的这种过程和特点，决定了HBV的存在方式，具有不同的血清型、基因型和准种等异质性（heterogeneity）的特点。 HBV病毒群的演变也符合达尔文进化论的规律。有些位点的变异，可能是致死性的，这部分变异的HBV不能存活。有些位点的变异对其复制能力没有显著影响，但很多位点变异导致子代病毒复制能力降低或增强。不同基因序列的病毒株在病毒群中所占的相对比例，一方面取决于病毒株自身的复制能力，另一方面也受到机体免疫压力选择的影响。核苷（酸）类似物的应用可改变病毒生存的外部环境，在治疗过程中病毒群也会发生相应的改变。 二、核苷（酸）类似物耐药变异相关概念及命名方法 （一）耐药变异相关概念 在临床实践中，常用的HBV耐药变异相关术语或概念有： 1. 原发性治疗失败（primary treatment failure）：指核苷（酸）类似物治疗3 ~ 6个月后，病毒载量的下降幅度较治疗前小于1 log10。原发性治疗失败可能与宿主、病毒或药物等因素相关，如药物不能在体内转换成有效成份、患者的依从性差、药物的抗病毒效力弱或治疗剂量太小等均可造成原发性治疗失败。 2．继发性治疗失败（secondary treatment failure）：指核苷（酸）类似物治疗初期，患者获得了病毒学应答，但随着治疗时间的延长，由于病毒耐药变异，出现了病毒学突破甚至反弹，从而导致治疗的失败。 3. 完全病毒学应答（complete virologic response）：指治疗24周，患者血清中HBV DNA载量低于60 IU/ml或300 拷贝/ml。 4. 部分病毒学应答（partial virologic response）：指治疗24周后，患者血清HBV DNA载量介于60 ～2000 IU/ml 或300 ～104拷贝/ml。 5. 不充分病毒学应答（inadequate/suboptimal virologic response）：指治疗24周，血清中HBV DNA载量下降幅度大于2 log10以上，但仍 ≥ 2000 IU/ml或 ≥ 104拷贝/ml。 6. 原发性耐药变异（primary drug resistance mutation）：指药物作用靶位的基因及其编码的氨基酸发生了变异，导致变异病毒株对治疗药物的敏感性下降。虽然原发性耐药变异株对药物的抵抗性增加，但也常导致变异病毒本身的复制能力下降。如rtM204V/I的变异病毒株对LAM的敏感性显著下降。 7. 补偿性耐药变异（compensatory resistance mutation）：指由于原发性耐药变异病毒株复制能力下降，在原发性耐药变异的基础上，病毒株也可在其他位点发生变异，这些变异导致其复制能力恢复。如在LAM的耐药变异中，rtM204V/I为原发性耐药变异，常常伴随的rtL180M变异为补偿性耐药变异。 8. 病毒学突破（virologic breakthrough）和病毒反弹（viral rebound）：指在治疗过程中，虽然患者对药物治疗有良好的依从性，相隔1个月的连续两次检查，血清HBV DNA载量比获得应答后的最低值的上升值均大于1 log10，病毒学突破常常提示耐药的产生。 当血清病毒载量达到20 000 IU/ml（注：1 IU/ml ≈ 5.26 拷贝/ml，Cobas Amplicor）以上或高于治疗前水平可称为病毒反弹。 9. 生物化学突破（biochemical breakthrough）：指治疗达到血清ALT复常后，在继续治疗的过程中，ALT水平升高并超过正常值上限。当ALT水平上升大于5倍正常值上限则称为肝炎突发（hepatitis flare），大于10倍正常值上限则称为恶化（deterioration/exacerbation）。 10. 基因型耐药（genotypic resistance）：指出现了导致药物靶位氨基酸变异的单核苷酸变异，这些变异在体外的表型分析研究中被证实与抗病毒药物耐药相关。通常通过对治疗中发生病毒学突破的患者治疗前后HBV株的核苷酸及其编码的氨基酸比较分析而确定是否存在基因型耐药，在缺乏治疗前资料的患者，通过与已发表的相同基因型参考株比较而确定。 11. 表型耐药（phenotypic resistance）：指将检测到的核苷酸变异及其编码的氨基酸替代变异病毒株，通过体外复制系统证实降低了其对抗病毒药物的敏感性。当抑制病毒复制所需的EC50与野生株相比增加100倍以上称为高度耐药、10～99倍为中度耐药、2～9倍为轻度耐药。 12. 交叉耐药（cross resistance）：指在抗HBV的治疗中，当使用一种药物造成这些靶位氨基酸变异后，这一耐药病毒株对其他具有相同作用靶位的药物也具有耐药性。如LAM治疗发生在rtM204I的耐药变异株，对LdT也具有耐药性。 13. 多药物耐药（multidrug resistance）：指当不同作用靶位的药物进行序贯或同时治疗，HBV可在不同药物的靶位发生耐药变异，产生对多种药物耐药的变异病毒株。如LAM治疗后，病毒变异发生在rtM204V/I和rtA181T/V，则该病毒株对LAM和ADV均耐药。 基因变异及其导致的药物靶位氨基酸的替代是导致病毒耐药的基础。在临床中首先出现基因变异，然后出现病毒学突破和病毒反弹，再出现生物化学突破（见图1）。对临床病毒耐药检测结果的解释，需要结合病毒载量的系列检测结果、检测试剂和方法及临床表现来综合分析。
（二）耐药的命名方法和书写格式 HBV聚合酶可分为4个不同的功能区：末端蛋白（terminal protein）、间隔区（spacer）、逆转录酶区（reverse transcriptase, rt）及RNA降解酶区（RNase H）。已知的耐药变异均位于逆转录酶区内。目前国际通用的HBV耐药变异从rt第1位氨基酸残基作为起始，书写格式为“rt-野生型氨基酸代码-相对于逆转录酶区起点的氨基酸变异位点-变异后的氨基酸代码”，如rtM204V表示逆转录酶区的第204位由蛋氨酸（M）变异为缬氨酸（V）。当在同一位点出现2种以上的核苷酸改变即混合HBV病毒群时，应同时将两者的氨基酸改变列出。例如，一个野生型和LAM耐药突变型的混合病毒群应报告为rtM204M/V。 三、核苷（酸）类似物常见耐药变异位点 1. 与拉米夫定耐药相关的变异：在LAM治疗过程中可选择性地出现逆转录酶基因变异，包括C区的rtM204I/V/S伴或不伴B区的rtL180M、rtV173L。体外实验证实LAM耐药变异可使病毒对其敏感性降低至少100倍，甚至大于1000倍。rtM204I变异可单独发生，而rtM204V和rtM204S变异的发生常伴有A区或B区的其他变异。rtL180M + rtM204V、rtL180M + rtM204I、rtV173L + rtL180M + rtM204V、rtM204I是LAM耐药变异的主要组合方式。rtM204V或 rtM204I变异可直接导致对LAM的强耐药性，rtV173L和rtL180M则为两个补偿性变异。由于YMDD基序（motif）直接参与HBV 聚合酶的催化反应，rtM204V/I变异不仅造成对LAM耐药，同时也会降低HBV聚合酶活性，因此rtM204V/I变异病毒株复制能力较野生型差。在rtM204V/I变异基础上增加rtV173L和/或rtL180M变异可提高rtM204V/I变异病毒株的复制能力。 2. 与阿德福韦酯耐药相关的变异: ADV耐药与逆转录酶B区rtA181T/V、D区rtN236T变异有关。有研究显示，位于C、D间区的rtV214A或rtQ215S及两点的联合变异也可能与ADV耐药相关。HBV的聚合酶基因区变异可使该药的EC50增加3～8倍，并且可导致ADV与TFV出现交叉耐药。引起ADV耐药的rtN236T变异株并不影响病毒对LAM的敏感性，但rtA181T/V、rtV214A、rtQ215S变异株可同时导致与LAM的交叉耐药。 3. 与恩替卡韦耐药相关的变异：目前研究结果显示，产生ETV耐药的先决条件是LAM耐药变异（rtM204I/V/S ± rtL180M）的存在。LAM耐药变异株rtI169T、rtT184A/G/I/S、rtS202G/I或rtM250V等变异的出现可造成对ETV的耐药性。体外试验显示：在未出现LAM耐药时，rtM250V可使该药的EC50增长9倍，而rtT184G + rtS202I并无耐药性。 4. 与替比夫定耐药相关的变异：体外试验表明，发生rtM204I变异或者rtL180M ＋ rtM204V双变异的对LAM耐药的HBV株对LdT抗病毒应答率可降低1000倍以上。体外试验还显示LdT对rtM204V变异的HBV株仍有效（效果降低1.2倍）。 HBV聚合酶分区、常见耐药变异位点及变异病毒株对药物敏感性的影响见图2和表1。 四、乙型肝炎病毒耐药变异的检测与分析 （一）常用基因型耐药检测技术 1. PCR产物直接测序（direct PCR sequencing）：该技术一次可准确测序HBV逆转录酶A～E区的全长549 bp。可通过一次实验，检测全部已知和可能的耐药变异位点。但该方法的灵敏性较差，只有当变异株超过HBV准种池（quasispecies pool）的20％时才能被发现。 2. 聚合酶链反应-限制性片段长度多态性（polymerase chain reaction-restriction fragment length polymorphism, PCR-RFLP）：该方法具有较强的灵敏性，可检测数量占HBV准种池5％的耐药变异株，曾被国内外众多实验室应用于LAM耐药变异检测工作中，近来国内也建立了基于该技术的ADV耐药变异检测方法。然而PCR-RFLP只能检测单位点变异，仅用于少数耐药变异位点监测时尚不失为一种简便、快速且廉价的方法。但随着多种核苷（酸）类似物的相继问世和HBV耐药变异位点的不断出现，该方法将难 以胜任。 3. 反向杂交法（reverse hybridization assay）：基于该技术的INNO-LiPA方法在国外已获准应用于临床检测。该法敏感性强，可检测变异株占HBV准种池5％～10％的低滴度样品，尚具有提供信息量大、自动化程度高等优点。但仪器、试剂价格昂贵，国内尚难应用于临床检测。 4. 实时PCR（real-time PCR）：该方法可检测变异比例大于10%的耐药变异，但仅能检测单位点变异。 国内已有经SFDA批准的实时PCR试剂盒用于rtM204V/I变异的临床检测。 5. 基因芯片（gene chip）：亦称DNA芯片（DNA chip）、DNA 微阵列（DNA microarray），具有快速、高效、敏感、平行化和自动化等优点，但因成本昂贵，目前尚难用于常规临床检测工作。 6. 基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（matrix assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry, MALDI-TOF MS）：该技术是近年来发展起来的一种软电离新型有机质谱，已成为检测和鉴定
* 补偿性耐药变异 # 产生ETV耐药变异的第一步 表1 耐药性变异对药物敏感性的影响
多肽、蛋白质、多糖、核酸、糖蛋白、高聚物以及多种合成聚合物的强有力工具，该技术具有灵敏度高、准确度高及分辨率高等特点，能够发现数量不足HBV准种池1％的变异株，但因设备昂贵，目前国内难以用于临床检测。 （二）体外表型分析 体外表型分析（in vitro phenotypic analysis）是确认基因型耐药的“金标准”，常用半数有效浓度（50% effective concentration, EC50）或半数抑制浓度（50% inhibitory concentration, IC50）来评价耐药程度的高低。其实验方法主要有两类：（1）聚合酶活性分析：以杆状病毒为载体在昆虫细胞内表达HBV聚合酶，而后进行聚合酶活性的体外研究；（2）体外药敏实验：利用病毒载体系统将含有待检测耐药变异位点的HBV全基因组导入肝细胞来源的细胞系，再将不同浓度的核苷（酸）类似物加入细胞培养液中，经过一定培养时间后检测细胞培养液中的HBV DNA载量，从而推断该变异对核苷（酸）类似物的敏感性。 （三）虚拟表型分析 进行虚拟表型分析（virtual phenotypic analysis）的前提是建立包含相互关联的临床资料、基因型和表型信息的HBV耐药变异数据库，并开发专用分析程序。当患者出现病毒学突破并检测到新型HBV变异位点时，应用分析程序搜索数据库，根据既往研究资料推测该变异位点是否为新型耐药变异。作为研究表型耐药的一个辅助手段，虚拟表型分析虽不能取代体外表型试验，但将有助于已知耐药变异的监测和新变异的发现。目前，可利用的数据库包括澳大利亚Evivar Medical Ltd开发的 SeqHepB、欧洲的ViRgil （European surveillance network for vigilance against viral resistance）和日本的HVDB（Hepatitis virus database）。 五、乙型肝炎病毒耐药变异的临床处理 (一)乙型肝炎病毒耐药变异的预测因素 多种因素可预测HBV对核苷（酸）类似物发生耐药几率。如治疗开始时HBV DNA载量高、有肝纤维化/肝硬化基础、曾接受过核苷（酸）类似物抗病毒治疗、耐药病毒株的适应能力强均提示高耐药风险。越来越多的研究提示早期病毒学应答情况也是预测耐药发生率的重要指标。此外，男性患者、体重指数高及酗酒等也是抗病毒治疗中易发生耐药变异的高危因素。 (二)乙型肝炎病毒耐药变异的预防策略 1.合理选择核苷（酸）类似物抗病毒治疗的适应证：对免疫耐受期或非活动期HBV感染者，尤其是年龄较轻者，如不需要接受免疫抑制剂或化疗药物治疗，则不建议应用核苷（酸）类似物。 2.合理选择抗病毒治疗方案：治疗方案参考中国“慢性乙型肝炎防治指南”（中华医学会肝病学分会与感染病学分会联合制订）。对有抗病毒治疗适应证的患者，若选用核苷（酸）类似物，尽量选用抗病毒作用强、耐药变异发生率低的药物；同时，一定要了解既往抗病毒治疗情况：核苷(酸)类似物应用情况、治疗应答情况及耐药变异情况，以便选择无交叉耐药的药物治疗。此外,应尽量避免单药序贯治疗，以免多药物耐药的发生。 3.提高患者的依从性：在用核苷（酸）类似物进行抗病毒治疗期间，要反复强调遵医嘱按时、足量服药。有资料显示相当一部分抗病毒治疗早期应答不理想或发生病毒学突破的患者是由于没有严格按医嘱服药。 （三）定期监测应答情况，及时调整治疗方案 治疗期间每3个月检测一次HBV DNA水平，如非依从性差所致，对原发性治疗失败或发生病毒学突破者要及时进行基因型耐药检测，并鉴定变异模式，以指导换用其他治疗方案。HBV DNA水平的动态变化是早期发现耐药变异的重要指标。但分析结果时需注意不同实验室和不同检测方法的敏感性有所差异。 (四)已发生耐药变异的临床处理建议 对少数治疗前ALT正常、肝组织学检查炎症或纤维化病变轻微（＜G1S1）者可停止抗病毒治疗，但需密切监测，一旦有肝炎突发，及时再抗病毒治疗；对绝大多数核苷（酸）类似物耐药者，尤其是失代偿期肝硬化患者，需及早进行挽救治疗（rescue therapy）。通常病毒学突破先于生物化学突破，在生物化学突破前进行挽救治疗可使患者免于发生肝炎突发、肝病恶化。 挽救治疗需根据病毒对不同核苷（酸）类似物耐药特点加用或换用无交叉耐药的核苷（酸）类似物（见表2）；如无禁忌证，亦可选用IFN-α或聚乙二醇化干扰素（PEG-IFN-α）。 表2 乙型肝炎病毒耐药变异的处理策略
注：LAM-R、ADV-R、ETV-R和LdT-R分别示LAM、ADV、ETV和LdT耐药；MDR，多药耐药；Truvada为TFV+FTC（恩曲他滨）复合剂；SFDA，国家食品药品监督管理局 *：IFN-α或PEG-IFN-α的适应证及禁忌证参考中国“慢性乙型肝炎防治指南”（中华医学会肝病学分会与感染病学分会联合制订） 核苷（酸）类似物耐药的临床研究刚刚开始，随着大量基础与临床研究的不断深入，将使临床耐药的诊断、处理更加规范。 |
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