荧光原位杂交（FISH）的实验步骤
FISH（Fluorescence In-Situ Hybridization）技术问世于20世纪70年代后期，是在原来的同位素原位杂交技术基础上发展起来的。其基本原理是，按照两个核酸的碱基序列互补原则，用特殊修饰的核苷酸分子标记DNA探针，然后将标记的探针直接原位杂交到染色体或DNA 纤维切片上，再与荧光素分子偶联的单克隆抗体和探针分子特异性结合，经荧光检测系统和图形分析技术对染色体或DNA纤维上的DNA序列定位、定性和相对定量。试验方法如下：
1）玻片处理
（a）玻片清洗：热肥皂水刷洗，1%盐酸浸泡24h，再在0.1%焦炭酸二乙酯（DEPC）中浸泡24h。
（b）硅化处理：玻片和盖玻片1%（质量分数）盐酸煮沸10min，烘干，锡纸包好4℃保存备用。
（c）明胶涂片制备：将烘干的玻片放入明胶中10min，然后60℃烘干过夜备用。
（d）试剂瓶、塑料器皿及组织匀浆器的处理试剂瓶、组织匀浆器先清洗干净，用1 mL/LDEPC (Diethyl Pyrocarbonate)水溶液浸泡处理(37℃、2h，室温过夜)，高压消毒去除DEPC，然后250℃烘干4h以上或200℃过夜。称量试剂勺也要干烤。塑料器皿最好用灭菌的一次性塑料用品，使用前进行高压消毒，为保证质量，凡使用的枪头、试管等均经0. 5mL/L DEPC水溶液处理3h以上，然后再高压灭菌，烘干。若为进口已处理的无RNase和DNase的枪头、试管可不必处理直接使用。
（e）各种溶液的配制：凡是水溶性液体均用1mL/L DEPC水配制。
2）样品制备及其所涉及的试剂包括：
（a）缓冲溶液
1×PBS缓冲溶液：NaCl 8g，Na2HPO4 2.9g，KCl 0.2g，KH2PO4 0.2g，溶入1000mL超纯水；
3×PBS缓冲溶液：NaCl 24g，Na2HPO4 8.7g，KCl 0.6g，KH2PO4 0.6g，溶入1000mL超纯水；
通常配制成10×PBS的储备液，3×PBS和1×PBS可用DEPC水稀释获得。
（b）4%多聚甲醛（Paraformaldehyde, PFA）
称取2gPFA加入30ml约60℃的热水，滴几滴20%NaOH放在磁力搅拌器搅拌至完全溶解。然后向其中加入16.5ml 3×PBS缓冲液，在冰浴中充分混匀冷却，冷却后，用HCl调整至中性（7.2左右），拿出搅拌子。向PFA溶液中加入超纯水，定容在50ml。用0.45微米的膜过滤后使用。（室温或4℃保存备用）。
注意：
1、配制时应在通风条件下操作，并避免接触皮肤和吸入（戴手套及口罩），因PFA有较强的固定作用及毒性，对粘膜及皮肤有固定及毒性，刺激作用；
2、加热时，温度不宜过高，常为60~65℃，否则，PFA降解失效；
3、配制好的PFA虽可存放一定时间，但过久的液体，固定效果下降，应尽早使用。
4% PFA是目前原位杂交组织化学技术中最常用的固定液，它能较好地保持组织及细胞内的RNA，同时对形态保持也较好。样品固定时间在2～3小时，RNA含量较为恒定。过度延长固定时间会引起细胞内生物大分子的过度交联，影响探针的穿透力，降低杂交效率。
（c）配制50%，80%，98%无水乙醇溶液，每个总量20mL。
（d）DAPI溶液
用1mlddH2O将DAPI溶解，制得2.9 mM的DAPI溶液（1mg DAPI/1mL H2O）。（DAPI不能直接用PBS等缓冲液溶解，需要先用水将其溶解）。取适量DAPI水溶液加到PBS中，制备成10～50 μM的DAPI溶液。
3）取样及保存方法
（a）反应器沉淀前取样2～5mL至离心管。
（b）离心（2000r/min）5min，去上清液（加蒸馏水重复两次）。
（c）样品加入1mL多聚甲醛，摇匀，4℃下放置3h。
（d）样品离心(12000r/min)5min，去上清夜。
（e）加入1×PBS，摇匀，离心(10000r/min)5min，去上清夜（重复3次）。
（f）加0.5mL 1×PBS，0.5mL无水乙醇，摇匀，-20℃保存（可保存6个月）。
4）样品固定：
稀释样品3～5倍，对样品进行超声处理（3W超声2～3min，沉降1min，去沉淀物，5W超声5min），将活性污泥絮体打散成单个细胞以便于显微镜计数。然后取3μL样品涂于包埋明胶的玻片上（检查样片本底），37℃的热烘箱固定2h（或者在空气中干燥2h或者过夜）。依次用50%、80%、98%（质量比）乙醇浸渍3min，对细胞进行脱水后，立放，并进行干燥。
5）样品杂交
试验所涉及的缓冲液包括杂交缓冲液（Hybridization Buffer, HB）和淋洗缓冲液（Washing Buffer, WB），其组分如表1-1和表1-2。
表1-1 杂交缓冲液（Hybridization Buffer）
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5% |
10% |
20% |
30% |
35% |
40% |
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0.05%SDS（μL） |
1.2 |
1.2 |
1.2 |
1.2 |
1.2 |
1.2 |
|
50mMTri-HCl（μL） |
24 |
24 |
24 |
24 |
24 |
24 |
|
5mol NaCl（mL） |
4.32 |
4.32 |
4.32 |
4.32 |
4.32 |
4.32 |
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甲酰胺（mL） |
1.2 |
2.4 |
4.8 |
7.2 |
8.4 |
9.6 |
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蒸馏水（mL） |
18.4548 |
17.2548 |
14.8548 |
12.4548 |
11.2548 |
10.0548 |
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探针 |
Nsm156 |
Ntcoc206 |
Ntspn693 |
Nsv443 |
Ntspa662 NSO1225 Nmv |
NIT3 |
表1-2 淋洗缓冲液（Washing Buffer）
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组分 |
体积 |
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0.05%SDS |
0.6μL |
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50m MTri-HCl |
12μL |
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5mol NaCl |
2.16mL |
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蒸馏水 |
42.8274mL |
（a）吸取2mL杂交缓冲液遍布在杂交盒内折好的吸水纸上，将已固定好样品的载玻片放入杂交管中，然后在46℃杂交炉中放置数分钟。
（b）吸取10μL探针贮存液和80μL杂交缓冲液混合后，用箔纸包好放入46℃杂交炉中
预热数分钟；探针贮存液浓度为25ng/μL，用无菌水稀释购买的探针，实验用的探针序列及杂交条件见表1-3所示。
表1-3用于检测样品中AOX、NOX的寡核苷酸探针及杂交条件
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探针 |
探针序列(5’～3’) |
标记细菌种属 |
浓度a |
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NSO1225 |
CGCCATTGTATTACGTGTGA |
Ammonia oxidizing beta-proteobacteria |
35 |
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Nsv443 |
CCGTGACCGTTTCGTTCCG |
Nitroso-spira, -lobus, -vibrio |
30 |
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Nmv |
TCCTCAGAGACTACGCGG |
Nitroso-coccus |
35 |
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Ntspa662 |
GGAATTCCGCGCTCCTCT |
Nitrospira |
35 |
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NIT3 |
CCTGGCTCCATGCTCCG |
Nitrobacter |
40 |
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Ntcoc206 |
CGGTGCGAGCTTGCAAGC |
Nitrococcus mobilis |
10 |
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Ntspn693 |
TTCCCAATATCAACGCATT |
Nitrospina gracilis |
20 |
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注：
（a） 表示杂交缓冲液中去离子甲酰胺浓度（%）
（c）吸取9μL预热后的探针稀释液涂于载玻片待测样品上，然后将载玻片迅速地移回杂交管中于46℃下进行杂交（黑暗中进行），杂交时间为2～3h；
（d）杂交后的洗脱：打开恒温水浴槽，加热到48℃，对杂交缓冲液、淋洗缓冲液进行预热。杂交盒中取出载玻片用杂交缓冲液冲洗样品后，快速放入淋洗缓冲液，48℃水浴20min后用4℃冰水，冲洗样品，样品洁净台中挥干。
DAPI染色
每孔滴9uLDAPI，4℃暗处5min，4℃冰水（BPS缓冲溶液）冲洗，挥干。用带有360 nm激发波长，460nm发射波长的滤光片的荧光显微镜观察细胞。DAPI（4，6-diamido-2-phenylindole）染色用于全细胞计数。
封片
涂封片剂，盖盖玻片，无气泡后指甲油封装。
荧光显微镜进行检测
每个样品及每个探针都采集20个不同区域。每个区域中的细胞个数要超过1000个，然后进行平均以获得每个探针对于每个样品的杂交结果。细菌丰度或细菌数目（cells/g或cells/L）为AS1/(S2V)，其中A为视野中细菌平均数；S1为样品涂抹面积；S2为视野涂抹面积；V为样品体积。
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