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第一台测序仪的诞生 454 生命科学（454 Life Sciences）可谓新一代测序技术的奠基人。它的创始人是生物界的传奇人士：Jonathan Rothberg。正如苹果砸牛顿一样，任何发明创造的背后都有个故事。Rothberg 的版本是这样的。当年，他的儿子一出生，就被送进婴儿特别护理病房接受治疗，那时 Rothberg 整天都在担心自己的孩子会不会天生有什么问题。于是，他下定决心要开发一种快速便宜的测序技术。
2005 年，Rothberg 的梦想终于实现了。454 生命科学等研究人员于 7 月在《 Nature 》杂志上发表了一篇题为“Genome sequencing in microfabricated high-density picoliter reactors ”的文章，介绍了一种边合成边测序（sequencingby synthesis）的技术，比传统的 Sanger 测序快 100 倍。 这种技术合成 DNA 片段，并将它们分开平行测序，再重新组合成基因组。它的效果也通过生殖支原体（Mycoplasma genitalium）这种细菌的测序而得到了证明。在 4 小时内，研究人员就完成了测序，且准确性超过 99.99% 。454 的方法之所以引起轰动，不仅是因为这个成果，而是因为它绕过了 Sanger 测序的限制，未来有望使测序时间和成本进一步下降。 人类基因组计划的首席科学家 Francis S. Collins 博士对此评价道：“测序技术需要变得更小、更快速、更便宜，才能满足个性化医疗的承诺。我们期待这种创新技术能够应用在生物医学研究，并最终应用于临床。”的确，随着通量提高 100 倍，这种技术开辟了测序的新用途，包括个性化医疗、传染病防治等。 不久之后，454 生命科学与罗氏合作，正式推出了 Genome Sequencer 20（GS20）系统。这是第一台商业化的新一代测序仪，为高通量的 DNA 测序提供了一个方便的方案。它在 PicoTiterPlate 上开展大规模并行测序，采用先进的图像处理，并利用独特的数据分析，以获得高质量的结果。样品制备之后，GS20 能够在 5 小时的运行内至少测序 2000 万个碱基（20 Mb）。 这台仪器甫一上市，就引起了科学界的关注。尽管价格不菲（50 万美元），但 2005 年总共在全球安装了 20 台，包括 Broad 研究院、Sanger 研究院和 JGI，研究成果也陆续发表。此外，GS20 也荣获了多个奖项，包括 R&D 100 大奖和华尔街日报的 2005 技术创新奖。 在收获掌声的同时，454 生命科学也在对 GS20 系统进行硬件和软件的升级，希望将读长从 100 bp 提高到 200 bp，甚至 400 bp，也力争大幅提高通量。这些后来都实现了。最初的一年，454 并没有碰到强劲的对手，但随着 Solexa 仪器的问世，这一局面很快被打破。
Solexa 闪亮登场
早些年，人们在谈到新一代测序仪时，经常会提起 Solexa，而不是 Illumina。这是一家低调的公司，规模也不大，但是测序技术却非常新颖。它开发出的测序仪，在通量上领先于其他竞争产品。收购 Solexa，也成为 Illumina 的转折点，从此踏上高速发展的道路。 Solexa 成立于 1998 年的夏天，创始人是剑桥大学的化学家。它的核心是可逆测序技术，也就是在大规模并行的芯片上，通过直径为 1 微米的孔，每次测序一个碱基并成像。他们的目标是每次运行能获得 10 亿个碱基（1Gb）。这在当时简直就像天方夜谭。风投告诉他们，如果能实现 1 Gb 的十分之一，就已经很不错了。 之后经过一系列改进，并从瑞士测序公司 Manteia 处收购了簇生成技术，也就是将 DNA 链扩增成含有 1000 个相同分子的簇，Solexa 的测序仪渐入佳境，读长也从最初的 12bp 稳步提高到 25bp。最后，研发人员开始建立 IT 系统，来管理和评估数据的质量。至此，Solexa 的测序仪已初具雏形。 2005 年初，Solexa 决定测序第一个真正的基因组，著名的 ΦX174 噬菌体基因组。2 月的一个周末，生物信息学家 Clive Brown 发邮件给同事，标题上写着：“我们做到了！”噬菌体基因组被重新测序，且准确性超过 99.9%。有趣的是，他们并没有发表文章。他们感兴趣的是专利。 过了一年，Solexa 正式推出 1G Genetic Analyzer，宣称能够在 3 个月内以 10 万美元完成人类基因组测序。对于 10 万美元的数字，CEO John West是这样解释的：“人类基因组有 30 亿个碱基，重测序的覆盖度大约是 15 倍。因此需要 45 亿个碱基。如果每个运行要两天，那就是 90 天。流动槽的定价将从 3000 美元降至 1000 美元，因此 45 个流动槽是 45000 元。如果考虑到仪器价格（40 万美元）和五年折旧，那么三个月就是 20000 元。” 不过，West 的承诺在 2006 年并没有实现。对于 30bp 的读长而言，人类基因组的组装是一项巨大的信息学挑战。当时，Sanger 研究院每周已经产生了 10-15 Gb 的数据。Clive Brown 开发出一款名为 the pipeline 的软件给客户使用，之后，它演化成为大家熟悉的 CASAVA。 2006 年 11 月，Illumina CEO Jay Flatley 向 Solexa 发出了 6.5 亿美元的收购要约，以补充 Illumina 当时的基因分型和基因表达平台。此次收购被剑桥大学新闻办公室认为是“剑桥大学最成功的商业化故事之一”。Flatley 表示：“这次收购可能会被证明是最成功的收购之一，以及生命科学史上的新技术引进。” Flatley 的预言并没有错。到 2007 年 2 月，Illumina 已经售出了 12 台仪器，之后又接到了几十个新订单。尽管它的读长远不及 454，但通量和每 Gb 的成本相当有利。到年底，GA 仪器的安装数量已超过 200 台，并在 2008 年再次翻番。2008 年春天，Illumina 推出了 GAII，硬件和软件都经过升级，读长提高到 50bp，通量达到每次运行 3 Gb。彼时，他们终于达到了 10 万美元人类基因组测序的里程碑。 之后的故事大家也许都听过了。2008 年 5 月，荷兰科学家利用 GA 首次绘制出女性的个人基因组图谱。11 月，《 Nature 》杂志发表了三个人类基因组图谱：炎黄一号–第一个亚洲人图谱；第一个癌症病人图谱；第一个非洲人图谱。这都有 GA 的功劳。 当时，Illumina 并非没有竞争对手。除了 454，Sanger 测序的领导者 ABI 也在开发新一代测序平台。Illumina 抢先进入市场，拔得头筹。正如 Illumina 科学家 John Milton 所言，这是 GA 领先 SOLiD 系统的主要原因。“一旦进入基因组中心，每个人都经过培训，那么他们就会坚持使用[这种技术]。”这也是 Sanger 研究院坚持使用 Illumina 平台的主要原因。 当然，ABI 并非等闲之辈，他们也在奋力追赶。
ABI 奋起直追 说起全自动测序仪，Applied Biosystems （ABI） 那是绝对的领头羊，其 3730 旗舰测序仪在人类基因组计划中立下赫赫战功。然而，在新一代测序方面，454 和 Solexa 抢了先机，率先推出了 NGS 仪器。ABI 当然不会作壁上观，让客户的实验室里摆满对手的仪器。 于是，它在 2006 年斥资 1.2 亿美元收购了遗传分析公司 Agencourt Personal Genomics （APG），为的是第二年将新一代测序系统推向市场。APG 的核心技术是 SOLiD （supported oligoligation detetion），其独特之处在于以四色荧光标记寡核苷酸的连续连接合成为基础，取代了传统的聚合酶连接反应，可对单拷贝 DNA 片段进行大规模扩增和高通量并行测序。 SOLiD 系统原本计划在 2008 年推出，但 ABI 扩大了研发团队，努力提高通量和读长。同时，早期试用客户也对这个系统给出了积极的反馈。因此，ABI 在 2007 年美国人类遗传学协会的年会上正式推出了 SOLiD 系统。仪器标价为 60 万美元，包括辅助设备和计算机，高于 454 和 Solexa 的仪器。 就当时而言，SOLiD 系统是通量最高的新一代测序平台，每次运行可以产生 4Gb 的数据。此外，由于它采用双碱基编码技术，在测序过程中对每个碱基判读两遍，能够区分测序错误和多态性，故原始数据的准确性接近 99.95%，高于其他的新一代测序平台。这也成为它的主要卖点之一。 2008 年，在 Illumina 宣布将人类基因组测序费用降至 10 万美元后不久，ABI 就宣布，利用 SOLiD 测序平台，人类基因组的测序成本低于 6 万美元。这个价格包括样品制备以及测序试剂的费用，但不包括人工和仪器折旧成本。而在一年前，454 生命科学对诺贝尔奖得主 James Watson 的基因组进行测序，费用接近 100 万美元。 在 ABI 科学运营高级主管 Kenvin McKeman 的指导下，科学家们采用 ABI 的 SOLiD 系统对国际 HapMap 计划中包含的一个人类 DNA 样本进行重新测序。SOLiD 系统总共运行 7 次，产生 36Gb 的序列数据，相当于 12 倍的覆盖度。单次运行最高可产生高达 9Gb 的数据，领先于其他测序平台。 McKernan 表示：“我们相信这项研究验证了新一代测序技术的前景，这些技术降低了分析人类基因组信息的成本，提高了精确度和速度。每个技术里程碑都使我们向着个性化医疗的方向迈进。” 至此，454、Illumina 和 ABI 在新一代测序领域形成了三足鼎立的局面。正是这种你追我赶，让人类基因组图谱的绘制成本大大降低，时间也大大缩短。不过，Illumina 率先进入大型的基因组中心，抢占了先机。此后它又推出了高通量的 HiSeq 系列，在通量上领先于 SOLiD。因此，ABI （及后来的 Life Technologies） 始终无力追赶。根据 Frost & Sullivan 对 2010 年 NGS 市场份额的统计，Illumina 占 69%，Life Tech 占 16%，Roche 占 15%。 好在，Life Tech 高瞻远瞩，放眼快速经济的测序市场，在 2010 年收购了 Ion Torrent 公司。尽管这种半导体测序仪未必适合 30 亿个碱基的人类基因组测序，但却是更多小型实验室的理想选择。
后起之秀 PacBio 在新一代测序技术崛起的早期，市场主要被 Illumina、Life Tech 和 Roche 这三家公司占领。偶尔也有一些新的测序平台出现，但大多是雷声大雨点小，不久便没了下文。面对这些强大、成熟的系统，新平台要想站稳脚跟，的确不是件容易的事。 在 2010 年的 AGBT 年会上，Pacific Biosciences 的测序仪吸引了众人的注意。这台名为 PacBio RS的测序仪被称为第三代测序平台，而有别于之前推出的二代测序平台。至于什么是第三代测序，PacBio 当时的 CEO Hugh Martin 是这样解释的，“它就是在第二代测序（通量、成本）的基础上添加非常长的读长、极低的试剂成本，以及快速的运行时间”。 的确，PacBio RS 系统有着其他系统无可比拟的读长，超过 1000 个碱基。这是因为 PacBio 的单分子实时 （SMRT） 测序反应是最接近天然状态的聚合酶反应体系，最大限度地保持了聚合酶的活性。此外，样品制备非常快速，只需要 4-6 小时，而不是几天。制备过程不需要 PCR，从而减少了错误和偏向。从样本制备到测序，所需的时间还不到一天。 对于重测序而言，短读长也许不是大问题，但是对于 denovo 测序，这可让人们吃尽苦头。例如，韩国极地研究所的 Hyun Park 在测序一种 GC 含量高达 71% 的极地微生物时发现，即使利用 Illumina 平台进行 200X 深度测序，仍无法获得完整的基因组图。组装时产生了 185 个 Contig，而且缺口数量太多，根本无法通过 Sanger 法有效补齐。他们只好求助于 PacBio，而后仅用 15X 覆盖度就能组装得到 26 个 Contig，最终获得了完整的基因组信息。 随后，《 Nature Methods 》上发表的一篇文章又再次让 PacBio 成为关注的焦点。研究人员利用 SMRT 技术，直接测定了 DNA 的甲基化，这是二代测序技术无法实现的，因为它们在测序前需要 PCR 扩增，一扩增这些修饰标记就被置换而消失殆尽了。SMRT 技术利用 DNA 聚合酶的动力学特征，对碱基掺入时产生的停顿间隔脉冲信号足够敏感，可区分 12 种以上不同类型的碱基修饰。这些信息也帮助解析了欧洲大肠杆菌疫情的元凶 E.coli O104:H4。 然而，PacBio 也受到高错误率的困扰。人们一听到 85-87% 的原始准确性就吓坏了。虽然 PacBio 也澄清，这是由于在测序过程中单个分子信号弱，偶尔会出现信号难于分辨的情况。出错几率是随机的，与序列长度、序列组成无关。只要提高循环次数，就能够提高准确率。不过，PacBio 的业务还是一度陷入低迷，股价在 1 块多徘徊。 2012 年，事情开始出现转机。冷泉港实验室的 Michael Schatz 开发了一种纠错算法，用二代测序的短读长高精确数据对三代长读长数据进行纠错，这种称为“混合纠错拼接”的算法发表在 7 月的《 Nature Biotechnology 》上。通过混合纠错法，他们发现“数据几近完美”。 这种方法融合了二代测序和三代测序的优势。“对于短读长，哪怕无限制地提高覆盖度，也不能解决复杂区域的测序问题。但长读长可以跨越这次复杂区域，因此不需要太高的覆盖度就可以对付。同理，长读长也可以用于检测并鉴定单倍体型和转录本的可变剪切，”Schatz 谈道。 第二年，PacBio 发布了新版本的测序仪 – PacBio RS II，平均读长达 5,000 bp，最长读长超过 20,000bp，且通量较之前的版本增加一倍。随着硬件和软件的不断升级，订单数量也开始增加。到 2013 年底，PacBio 更与 Roche 合作，联手打造一款临床测序产品。此后，引用 PacBio 系统的研究成果不断在各种刊物上发表。 Illumina 超高通量测序平台 HiSeq X Ten 的上市也为 PacBio 带来了新订单。韩国公司 Macrogen 和 J. Craig Venter 的 Human Longevity 在安装了 HiSeq X Ten 系统之后都购买了两台 PacBio RS II 系统。他们在开展大规模人类基因组测序研究时，希望利用 PacBio 的长读长来弄清结构变异及其他复杂区域。 至此，PacBio 完成了一次漂亮的逆袭。它凭借自身的独特优势，在竞争激烈的新一代测序市场上站稳脚跟，并带来丰硕的研究成果。当然，仪器仍在不断升级。最新型号的 Sequel 测序仪将在明年上市。
转自《生物探索》 |
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