【干货】去除组织自发荧光干扰的利器—白激光Lightgate门控技术

当今生命科学研究的趋势正在从离体（in vitro）实验逐渐走向活体在体（in vivo）实验。但是在体（in vivo）荧光显微成像的一大障碍在于，动植物组织普遍存在光谱宽泛的自发荧光干扰，由此会产生很多假阳性结果。另外，动植物组织导致的激光反射光和杂散光等信号，也会大大降低荧光图像的信噪比，影响成像质量。

全新的徕卡SP8 X白激光Lightgate时间门控技术，可从时间维度完全去除自发荧光、反射光和杂散光等信号的干扰，使得组织和在体（in vivo）成像的荧光图像具有更好的信噪比和更高的可信度。

自发荧光的激发和发射光谱通常非常宽泛，有些具有多个激发峰，有些则没有明显的激发峰，可见光内任何谱线都能对其激发出荧光信号（图1），而且自发荧光的光谱经常与人工标记的光谱有很大范围的重叠，例如各种种类的血红素与很多红色染料之间就存在大面积的光谱重叠(1)。对于这类自发荧光的干扰，序列扫描就无能为力了，常规的光谱拆分也收效甚微。正是由于自发荧光的普遍存在，从而限制了很多在体实验的开展。

图1不同类型血红素（Hb）自发荧光的光谱特性

在传统共聚焦荧光成像中，只能从光谱维度进行信号的分离与检测。当碰到光谱非特异的自发荧光时，只从光谱维度进行信号分离，并不能把自发荧光干扰完全去除。众所周知，激发与发射光谱、荧光寿命是荧光的两大主要属性，不同种类的荧光除了光谱参数不同之外，还有着各自特定长短的荧光寿命(表2和表3)。其实，我们还可以从时间维度对信号再次进行分离（即Lightgate时间门控成像），可将自发荧光的干扰几乎完全除去。

表1. 常见荧光蛋白的荧光寿命

 表2. Alexa Fluor系列染料的荧光寿命

众所周知，荧光寿命成像需要脉冲式的激光光源。徕卡白激光（WhiteLight Laser）是从470nm到670nm激发谱线自由可调的激光光源，同时又是一个脉冲式的激光光源，其脉冲频率正好适合于常规染料的荧光寿命成像。徕卡HyD混合型检测器具有灵敏度高、背景噪音低、动态范围大、读取速度快等特性。徕卡HyD与白激光整合后，即可实现时间门控（gating）成像，在白激光的两个脉冲激发之间，HyD检测器的时间窗口自由可调，可从时间维度来避开自发荧光、激光反射光和杂散光等信号的干扰（图2）。

图2 徕卡白激光和HyD相结合实现的Lightgate时间门控技术原理示意图

1Lightgate去除植物叶片表面反射光信号

植物叶片表面一般会分泌一层蜡质，用于抵御昆虫和病原菌的侵染。在用共聚焦对植物叶片成像时，这一层表面光滑的蜡质会导致很强的激光反射光干扰（图3a）。激光反射光在时间维度上，是与激光脉冲同时出现的，所以我们通过HyD检测器延后0.1ns开始收集信号，就可以把激光反射光信号完全去除，使得点状GFP标记的线粒体结构看得更加清楚（图3b）。

图3拟南芥叶片表皮细胞共聚焦成像

a.   时间门控成像，图中三角形所指为叶片表面蜡质的反射光信号；

b．时间门控成像，gating范围0.1-12ns，图中箭头所指为GFP标记的线粒体。

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Lightgate去除细胞壁自发荧光

植物叶片表面的保卫细胞，成对分布在植物叶片气孔周围，双子叶植物的保卫细胞通常是肾形的细胞，因为细胞壁面对孔隙的一侧（腹侧）比较厚，而外侧（背侧）比较薄，所以随着细胞内压的变化，可进行开闭运动，控制进出叶子的气体和水分的量。细胞壁的主要组成成分是纤维素，它形成细胞壁的框架，在一些成熟和加厚的细胞壁中，常沉积木质素。而纤维素和木质素在绿色波段都有较强的自发荧光，所以在保卫细胞的腹侧能观察到很强的绿色自发荧光信号（图4a）。植物细胞壁的自发荧光寿命相对较短，延后0.3ns即可完全去除，而在0.3ns之前GFP发射出的光子数量极少，此时对GFP的信号强度几乎没有影响。

图4拟南芥叶片保卫细胞共聚焦成像

a、为非时间门控成像；d为时间门控成像，gating范围0.3-12ns；b、e为叶绿体红色荧光；c、f为红绿叠加图像。图中箭头所指为保卫细胞腹侧的细胞壁自发荧光。绿色为GFP标记的线粒体，红色为叶绿体自发荧光。

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Lightgate去除气泡导致的杂散光信号

很多时候，制样过程中的缺陷和瑕疵也会导致背景杂散光信号的干扰以及荧光图像质量的下降。植物叶片的表皮细胞凹凸不平，在压片的时候，很难把叶片与盖玻片之间的气泡完全挤出。残留其中的气泡在荧光成像的时候会导致很强的杂散光信号干扰。通过常规三维成像，我们可以清晰地看出杂散光信号呈现出的气泡形态，而且旁边的保卫细胞腹侧也有很强的细胞壁自发荧光信号（图4a）。通过时间门控延迟0.3ns后开始采集图像，细胞壁的自发荧光和气泡的杂散光信号一同被完全去除，但对于线粒体来源的GFP信号无任何影响。这使得在做活  体组织成像时，结合时间门控技术，能获得更好信噪比的三维重构图像。

图5 拟南芥叶片三维重构图像

a为非时间门控成像；b为时间门控成像，gating范围0.3-12ns。图中箭头所指为保卫细胞腹侧的细胞壁自发荧光，三角形所指为气泡导致的杂散光。绿色为GFP标记的线粒体，红色为叶绿体自发荧光。

动物体内色素类的组分是其自发荧光的主要来源，例如皮毛和血液的自发荧光，黑色素是皮毛中主要的自发荧光源，而血红素是血液中主要的自发荧光源。Huan-ChengChang等人选用荧光寿命为20ns的荧光纳米钻石（fluorescentnanodiamonds，FND）进行人工标记，通过时间门控可以很好地去除短寿命的血红素自发荧光信号干扰，大幅提高图像的信噪比，从而使得在活体小鼠耳部血管中对FND标记的肺癌细胞追踪变成更加轻松(1)。该课题组还通过FND标记肺部干细胞，然后将其移植入肺部损伤的小鼠体内。结合时间门控成像，他们发现FND标记的肺部干细胞优先聚集在肺部受伤小鼠的末端细支气管中(4)。这使得我们能在活体动物中能更加客观地了解移植干细胞的相容性以及其在宿主体内的再生修复能力。

图5人血液中FND标记细胞的成像（a为无时间门控成像，b为时间门控成像）

自发荧光的干扰成为在体荧光成像的一大瓶颈，使得在生理状态下的组织和细胞内的物质追踪等应用变得异常困难。在各种去除自发荧光的各种方法中，Lightgate时间门控技术是目前最快捷而有效的一种方法，同时可以应用于z-stack、时间序列等各种成像方式中，结合某些特殊的染料标记，使得活体荧光动态多维追踪变得更加轻松。

实验材料与成像方法

本实验中使用的拟南芥（Arabidopsisthalinana）材料为绿色荧光蛋白（GreenFluorescent Protein, GFP）定位在线粒体β-ATPase亚基上的43A9株系14天幼苗（材料由中山大学生命科学学院姚楠实验室提供）。

我们使用HCX PL APO CS2 100× (NA 1.4)油镜，在激光共聚焦显微镜（LeicaTCS SP8 X）下使用HyD检测器对43A9株系叶片表皮和保卫细胞进行了荧光成像，绿色和红色通道均采用488nm激发，反射光检测范围分别为500-550nm和653-790nm。