手把手教你搞定CRISPR/Cas9 系统操作

今天我们邀请冰糖来介绍 lentiCRISPR v2 应用指南。

lentiCRISPR v2 说明

• 克隆 gDNA 使用 BsmBI 位点，载体可以切出一个~1.9 kb 的 filler 片段，便于 confirm 酶切成功并利于载体回收。

• BsmBI 的位点如图所示：

酶切之后不需要 CIP 脱磷也不会自连。

• Cas9 的 COOH 端带有 FLAG tag, 可以 WB 或者 Immunostaining。

• EFS promoter 被优化的小而强，极大提高了慢病毒包装的效率。

  
  

• 载体带有 Puromycin 抗性，可以富集转染/感染成功的细胞。

参考文献：

Improved vectors and genome-wide libraries for CRISPRscreening. Sanjana NE, ShalemO, Zhang F. Nat Methods. 2014 Aug;11(8):783-4. doi:10.1038/nmeth.3047. 10.1038/nmeth.3047 PubMed 25075903

gDNA 设计说明

gDNA 设计方法和原则请查看「CRISPR/Cas9 系统操作指南一」。请加颜值担当菌菌，微信号：biotalk。注明 protocol 就会给到你《CRISPR/Cas9 系统操作指南一》。

对于 lentiCRISPR v2 克隆，其合成的 oligo 末端和 pX330 不同，请注意设计。

举个例子说明（千万注意 oligo 的方向）

载体克隆说明

1.Backbone 的酶切体系与文章「CRISPR/Cas9 系统操作指南一」一样，不脱磷处理参考图 1 中的操作，脱磷处理参考图 2 中的操作。

2.Oligo 的退火条件也与文章「CRISPR/Cas9 系统操作指南一」一样。

注意：如果载体不脱磷，oligo 不需要磷酸化；载体脱磷参考图 2（FengZhang 提供的 protocol，设计脱磷，可以参考），oligo 就需要加磷处理。

图 1

图 2

病毒包装体系

包装病毒使用的包装体系如下（for 100 mm dish， 6x10⁶ 293T）

4 μg	lentiCRISPR v2-gDNA plasmid
3 μg	psPAX2 packaging plasmid
2 μg	pMD2.G envelope plasmid

转染条件：用细胞转染试剂 lipofiter。DNA:lipofiter=1 μg：2.5 μL

收集 48 h 和 72 h 病毒上清，待用。

此处病毒包装的 protocol 没有列出，如果想看，请加颜值担当菌菌，微信号：biotalk。注明 protocol 就会给到你《CRISPR/Cas9 系统操作指南一》。

目的细胞系的感染

• 转染 （2μg  plasmid/60 mm dish，细胞密度 60～80%）【v2=lentiCRISPR v2，下同】

• 感染 （1～5 mL 病毒上清）【v2=lentiCRISPR v2，下同】

KO 单克隆的获取

• 有限稀释法：50～100 cells 均匀分到 96-well plate

• 单克隆挑取法

KO 单克隆的鉴定

• 直接测序或者 T7E1 或者酶切鉴定：鼠尾直接 PCR 试剂盒 (快速基因型鉴定) ，直接取细胞进行 PCR，然后测序或者做 T7E1 或者酶切鉴定即可。

测序看套峰

T7E1 assay

酶切鉴定

• WB 鉴定

如果抗体好用，直接用 Dot blot 也很快， 通量高。

文章来源：文章由冰糖授权转载