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我们用最容易理解的方式对ChIP技术中关键概念和问题进行剖析，大家会对原理和应用有“恍然大悟”的感觉，我们的目标是：让ChIP技术成为每个实验室最“Easy”的技术。 1：什么是ChIP技术？也许你会认为这个问题太low了吧！教科书上都明明白白的写着：染色体免疫共沉淀（Chromatin immunoprecipitation，ChIP）是一种可在体内用来确定与某一特定蛋白结合或蛋白定位所在的特异性DNA序列的技术。 其实这个定义理解起来还是有一点拗口，小编另辟蹊径，告诉你一个不一样的ChIP概念，我们将“染色质免疫共沉淀”拆成“染色质”“免疫”和“共沉淀”3个词分别简单解释，大家更能一目了然。 “染色质”就是由“组蛋白和DNA”组成的物质； “免疫”就是通过抗体和靶蛋白（抗原）特异性结合，这里指用商品化或自制抗体和染色质中组蛋白结合，形成复合物； “共沉淀”就是2-3种物质形成的复合物通过沉淀的方法来分离。所以ChIP技术就是“利用染色质中组蛋白和外源抗体的特异性结合，将染色质沉淀下来并进行分离“。 其实就是为了想拿到染色质中的”DNA“，为什么呢？因为染色质中的组蛋白是已知的（无论选择商品化还是自制抗体，抗体结合靶标必须很清楚），所以染色质中只有“DNA”是未知的，ChIP实验的最终目的就是进行DNA检测。 这样解释概念，大家一定很清楚，进一步将ChIP核心步骤串起来理解也很容易： 你也会明白为什么做ChIP的时候最后都会用PCR或是测序（Seq）等方法进行检测，其实都是针对染色质中DNA。 再回答ChIP实验中大家最关心的几个问题，比如转录因子操作的注意事项，抗体的选择，PCR和Seq的选择及注意细节： 2： ChIP实验只研究组蛋白的DNA吗？为什么我看到很多文献都是针对其他蛋白因子，研究转录因子，调控因子和组蛋白的操作上有什么不同？ ChIP实验的靶蛋白，不仅包括组成染色质的组蛋白，也包括转录因子和调控因子（只要在转录过程中涉及的蛋白均属于ChIP研究范围）。组蛋白在染色质中表达相对较高，表达也较稳定，而转录调控因子表达水平很低，往往是瞬时表达，所以组蛋白研究起来更为容易。 早期ChIP实验主要集中在组蛋白结合的DNA进行研究。随着分子生物学及技术水平的发展，大家逐渐转向更具有研究价值的转录/调控因子，需要提醒大家的是：转录因子表达水平更低，起始样本量（细胞，组织）要是组蛋白的10倍，一般每个反应至少需要107个细胞。 另外有些转录因子比较大，往往结合多个核小体，因此在染色质断裂的时候，不太适合使用酶法的处理方式，因为酶法处理的位点是在核小体的连接处，酶消化有可能将核小体断裂的同时打断转录因子与DNA的结合，推荐使用超声法断裂。 3：ChIP实验中需要选择ChIP级别抗体，没有ChIP级别抗体该怎么选择？ 在ChIP实验中，抗体的选择尤为关键，是实验成功的核心要素。在2011和2015年的两篇Nature[1,2]报道中通过斑点杂交和ChIP-chip试验显示，分别只有73%和78%的抗体具有较好特异性。WB检测3种表观抗体仅有一个品牌（Millipore）抗体通过特异性检测，另外两品牌抗体未通过特异性结合实验。 图：Western blot of anti-H3K4me2 (Millipore, 07-030, lot DAM1543701), anti-H3S10ph (Wako, 303-35199), and anti-H4K20me3 (Diagenode, CS-057, lot A9-002). 但是由于ChIP级别（ChIP验证过的）抗体数量非常有限，所以当没有ChIP级别抗体时，我们有如下3种方法可以考虑： 选择IP/IHC/ICC进行尝试，一般在这些实验中抗体对蛋白的识别结构是native，和ChIP抗体识别结构较为相似；不建议尝试Western blot抗体，因为WB抗体识别的蛋白结构多是denature，并不适合ChIP实验； 将蛋白的序列放在NCBI上进行Blast，如果蛋白序列同源性与其他种属或物种蛋白超过80%，可以尝试跨物种抗体； 可以使用标签抗体，但是标签页可能干扰转录因子并可能引入假阳性相互作用，因此需要设置好对照，包括未转染细胞的mock IP对照；以及将标签从N端转换到C端作为对照。 此外，由于很多品牌的ChIP级别抗体[1,2]在实验中特异性并不理想，因此大家针对ChIP级别抗体的可信度也要有一定了解，给大家推荐一个非常好的方法，通过全球最大抗体查询网站CiteAb（http://www./）进行查询，能够获得每个ChIP抗体的文献引用次数（CiteAb显示Merck旗下多种表观遗传抗体全球使用率排名第一） ▲点击可查看大图 4： ChIP实验中DNA的检测在什么情况下用PCR反应？什么情况下用测序？ 当我们已知蛋白结合的DNA序列的时候，可以使用PCR反应进行检测，PCR可以使用End point PCR和Q-PCR方法，在PCR的时候除了样本组外，还需要设置input 对照，阴性对照和空白对照。PCR扩增片段长度200-400bp最佳，模板DNA片段过长，结合位点的邻近DNA会出现一定程度的信号富集。 但是有些情况下，蛋白结合的DNA序列是未知的，这时我们需要使用ChIP结合测序（Seq）方法检测，ChIP-Seq一般包括3个步骤：ChIP反应?文库构建?测序。 创新成就更多发现——RNA研究新方法和工具（顶级期刊和您分享表观遗传学之RNA研究最新进展和方法） Upstate （Merck子品牌）1990, 推出全球首款ChIP试剂盒（>50000篇文献引用）； 2009，推出全球首款RIP试剂盒（>7000篇文献引用）； 2010，全球20000篇文献使用Merck表观抗体； 2010，推出全球首款EZ-ChIP试剂盒； 2014, 推出全球首款Nuclear RIP试剂盒； 2014，推出全球首款最高灵敏度ChIP试剂盒 2015， 推出全球首款ChIRP试剂盒 文章转至：默克生命科学 诚聘兼职编辑：只要您认为自己的思维足够有逻辑、对研读最新Paper感兴趣，欢迎加入我们。 有意向者，请发邮件至marketing@abbiomall.com。经过审核后，我们会第一时间与您联系并沟通稿酬。（邮件需附上个人简历） 微信咨询：abbiomall02 细胞之邦——剖析细胞、分子、免疫学实验 及分享实验培训、讲座、科研工具的平台 |
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