番茄紅素的微生物合成及發酵生產研究進展

番茄紅素的微生物合成及發酵生產研究進展

吳軍林1,2，吳清平1，張菊梅1，莫樹平1，柏建玲1

(1.廣東省微生物研究所，廣東省華南應用微生物重點實驗室-省部共建國家重點實驗室培育基地，廣東省微生物菌種保藏與應用重點實驗室，廣東省微生物新技術公共實驗室，廣東 廣州 510070；2.廣東環凱微生物科技有限公司，廣東 廣州 510643)

摘要：微生物發酵法是番茄紅素生產的最佳方法。番茄紅素的生物合成途徑有2-甲基-D-赤蘚糖醇-4-磷酸鹽(MEP)及甲羥戊酸(MVA)兩種途徑。異戊烯焦磷酸異構酶、氂牛兒基焦磷酸合成酶、法呢基焦磷酸合成酶、氂牛兒基氂牛兒基焦磷酸合成酶、八氫番茄紅素合成酶、八氫番茄紅素去飽和酶、ζ-胡蘿蔔素去飽和酶和胡蘿蔔素異構酶等是番茄紅素合成的關鍵酶。通過誘變、基因重組和基因敲除等方法調節修飾生產番茄紅素的關鍵酶來改變番茄紅素合成工藝及其產量。近年來，在利用細菌、黴菌、酵母等微生物發酵生產番茄紅素方面進行了大量研究，並研發出了一些新的番茄紅素髮酵生產工藝，為提高番茄紅素產量及降低生產成本提供了良好啟發。

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關鍵詞：番茄紅素；微生物；合成；基因工程

中圖分類號：TS201.2

文獻標誌碼：A 文章編號：1002-6630(2013)19-0336-05

番茄紅素(lycopene)是一種類胡蘿蔔素，因最早發現於番茄中而得名。1873年，Hartsen首次從番茄漿果中提取出來一種呈深紅色的晶體。1903年，Schunch將這種從番茄中提取到的物質正式命名為番茄紅素。番茄紅素習慣上被認為是一種色素，廣泛存在於自然界中，素有「藏在西紅柿里的黃金」之美稱，已被聯合國糧農組織(FAO)、食品添加劑委員會(JECFA)和世界衛生組織(WHO)認定為A類營養素，並被50多個國家和地區作為具有營養與著色雙重作用的食品添加劑[1]。近年來，因其具有抗氧化、抗癌、降血脂、提高免疫力等多種生理活性功能，而廣泛應用於保健食品、醫藥、化妝品等行業，相關產品的開發已成為國際功能食品研究領域的熱點[2]。目前常見的生產番茄紅素的方法有3種：微生物發酵法、化學合成法及天然提取法。化學合成法一般以β-紫羅酮作為原料合成番茄紅素，由於化學合成法的產品有化學試劑及中間產物殘留，導致一定的毒性和致癌性，限制了產品質量和使用範圍[3]。天然提取法主要從番茄中提取番茄紅素，成本高，產率低，無法滿足市場需求。微生物發酵法生產成本低，易於大規模培養，產率高，被認為是最有前途的方法。

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1·番茄紅素的生物合成

番茄紅素的合成代謝與調控一直是代謝領域研究的熱點。目前，以三孢布拉氏黴菌(Blakeslea trispora)，大腸桿菌(Escherichia coli)等為模式微生物的番茄紅素生物合成途徑已經闡述清晰[4]。番茄紅素合成的直接前體是異戊烯焦磷酸(IPP)，IPP是異戊烯代謝途徑中各種產物的共同前體，依據生物體合成IPP來源不同，番茄紅素的生物合成分為兩條途徑，一種是2-甲基-D-赤蘚糖醇-4-磷酸鹽(2-methyl-derythritol-4-phosphate，MEP)途徑合成，存在於細菌等原核微生物中；另外一種是甲羥戊酸(mevalonicacid，MVA)途徑合成，存在於真菌等真核微生物中。三孢布拉氏黴菌合成番茄紅素由乙醯CoA開始，生成乙醯乙醯CoA，再經羥甲基戊二酸單醯-CoA形成甲羥戊酸(MVA)，再經過兩步激酶反應，產生甲羥戊酸焦磷酸，然後脫羧生成番茄紅素合成的前體物質IPP，詳細合成途徑見圖1。細菌合成番茄紅素由3-磷酸甘油醛與丙酮酸通過依賴於硫胺素的1-脫氧木酮糖-5-磷酸合成酶(DXS)催化縮合，再由I-脫氧木酮糖-5-磷酸還原異構酶(DXR)轉變為2-甲基-D-赤蘚糖醇，然後產生IPP，與三孢布拉氏黴菌合成番茄紅素途徑一樣，再在crtE、crtB、crtI基因的控制下合成番茄紅素[4]。

從IPP合成番茄紅素途徑中參與的酶有：異戊烯焦磷酸異構酶(isopentenyl diphosphate isomerase，IPI)、氂牛兒基焦磷酸合成酶(geranyl pyrophosphate sythase，GPS)、法呢基焦磷酸合成酶(farnesyl pyrophosphate sythase，FPS)、氂牛兒基氂牛兒基焦磷酸合成酶(geranylgeranylpyrophoaphate sythase，GGPS)、八氫番茄紅素合成酶(phytoene synthase，PSY)、八氫番茄紅素去飽和酶(phytoene desaturase，PDS)、ζ-胡蘿蔔素去飽和酶(ζ-carotenedesaturase，ZDS)和胡蘿蔔素異構酶(caroteneisomerase，CRTISO)，祝光濤等[5]對番茄紅素生物合成途徑中關鍵酶的報導已比較清晰。

2·番茄紅素生產菌種構建

2.1 番茄紅素生產菌種的誘變

目前利用三孢布拉氏黴菌(Blakeslea trispora)兩性菌株發酵生產β-胡蘿蔔素產率較高，已達工業化水平。許多學者選育番茄紅素生產菌種通常以Blakeslea trispora為出發菌株，採用誘變育種的方法選育。Mehta等[6]採用亞硝基胍對野生三孢布拉氏黴菌：菌株(+)F986和菌株(-)F921進行突變改良，獲得兩性突變體菌株，在含有尼古丁培養基中，該菌株番茄紅素的產量達15mg/g，較出發菌株提高了1.2倍。王永生等[7]對三孢布拉氏黴菌採用物理誘變和化學誘變相結合的方法進行誘變，得到誘變菌株203(+)和204(-)，與親本菌株相比較，生產β-胡蘿蔔素的能力提高了10倍以上，達到830mg/L左右，通過發酵工藝研究後，番茄紅素的產量達到400mg/L。任龍[8]以三孢布拉氏黴菌作為誘變育種的出發株，進行兩次Co-γ輻射處理，選育出兩株產番茄紅素的突變株，番茄紅素的產量達661.8mg/L，進一步發酵工藝優化，番茄紅素產量最高達到1295.6mg/L。王敏等[9]以一株龜裂鏈黴菌(Streptomycesrimosus)Fc作為出發菌株發酵生產番茄紅素，通過紫外誘變篩選到一株突變高產菌株Fc′，其番茄紅素產量較出發菌株提高2.5倍，通過優化培養條件，使菌株Fc′的番茄紅素產量達到230mg/L。紅酵母產番茄紅素的產量雖不如三孢布拉黴菌，但其具有營養需求簡單、生長周期短等優點，近來作為番茄紅素生產菌的研究也比較活躍。汪福源等[10]通過誘變紅酵母，獲得生物合成番茄紅素的RY-17菌株，在最優條件下，紅酵母的生物量為6.92g/100mL、番茄紅素含量為5.53mg/L。目前因缺乏有效手段，利用誘變方法來獲得高產番茄紅素的菌種很困難，僅通過觀察菌絲體的顏色變化進行篩選，絲狀真菌由於多核體的存在，其隱形突變體的分離存在障礙。

2.2 改變番茄紅素合成途徑

隨著番茄紅素合成途徑的闡明和相關酶基因的克隆，構建基因工程菌也成為篩選高產番茄紅素生產菌種的有效手段。改變番茄紅素合成途徑的方法主要是在不合成番茄紅素的微生物體內構建番茄紅素合成途徑。大腸桿菌(Escherichia coli)、產蛋白假絲酵母(Candida utilis)和釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)本身都不能合成番茄紅素。Wang等[11]從野生型紅桿菌(Rhodobacter)獲得crtI克隆，進行定點誘變後，篩選出促進類胡蘿蔔素合成的克隆子，使其在大腸桿菌中過量表達，同時將含有其他基因(dxs，1-脫氧木酮糖-5-磷酸合成酶基因；gps，GGPP合成酶基因；crtB，八氫番茄紅素合成酶基因)的質粒也轉入大腸桿菌，產生了胡蘿蔔素類物質混合物(番茄紅素含量達90%)，創建了新的代謝流。由於大腸桿菌中含有IPP，Misawa等[12]把克隆自噬夏孢歐文氏桿菌的crtB及crtE基因轉人大腸桿菌，獲得了合成八氫番茄紅素的菌系E.coli JM 109，然後再將番茄紅素合成酶基因(crtI)轉入E.coli JM 109可合成番茄紅素。

酵母本身能夠合成麥角固醇，不能合成番茄紅素，但這兩種物質的合成利用共同的前體物質，通過番茄紅素合成途徑的構建能改變菌體內物質的流向，可產生番茄紅素。Yamano等[13]用噬夏孢歐文氏菌(Erwinia uredouora)的crtE、crtB、crtI等番茄紅素合成關鍵酶基因和酵母基因的啟動子、終止子控制元件，構建了可在酵母中表達的質粒Y5143，轉入釀酒酵母S.cerevisiaeR7產生了113μg/g(干基)的番茄紅素。而與釀酒酵母相比較，產元假絲酵母體內積累的麥角固醇含量是它的2～3倍，Kondo等[14]利用crtE、crtB、crtI基因和酵母基因的啟動子、終止子控制元件構建了pCLEB113-2質粒，轉化產元假絲酵母C.utilis IFO 0988，番茄紅素的產量達到了758μg/g(干基)，Miura等[15]用來源於歐文氏桿菌(Erwiniauredovora)的crtE、crtB、crtI等番茄紅素合成關鍵酶基因及其啟動子經克隆重組後轉入產蛋白假絲酵母中，利用酵母原有的前體甲羥戊酸產生新的代謝流，使得產蛋白假絲酵母合成1.1mg/g(干基)的番茄紅素，Shimada等[16]在該工程菌的基礎同時敲除ERG9基因和過表達HMG基因，構建的工程菌合成番茄紅素的產量達7.8mg/g(干基)，通過基因工程技術利用產元假絲酵母生產番茄紅素更具有應用前景。近來，畢赤酵母作為番茄紅素生產菌已有報導。Araya-Garay等[17]及Bhatayaa等[18]以畢赤酵母(Pichiapastoris)X33為出發菌株，將產番茄紅素的關鍵基因表達到質粒中，構建的工程菌在甲醇等有機物條件下高密度培養，菌體番茄紅素產量達4.6mg/g(干基)，發酵液中番茄紅素產量達73.9mg/L。將參與β-胡蘿蔔素的合成基因整合到染色體中，構建的工程菌番茄紅素和β-胡蘿蔔素產量分別為1.141μg/g(干基) 和 339μg/g(干基)[17]。

2.3 增加番茄紅素合成過程中關鍵酶的表達量

通過外源導入限速酶基因，增加前體物質向番茄紅素合成方向的代謝，可顯著提高微生物體內番茄紅素的產量。Kajiwara 等[19]發現並證實了IPP轉化為DMAPP 是萜類物質合成的限速步驟，增強IPI的表達可顯著提高類胡蘿蔔素的產量，分別將從酵母(Pharffi arhosozyma)和雨生紅球藻(Haematococcuspluvialis)中分離得到的IPI基因與噬夏孢歐文氏菌(Erwinia uredovora)類胡蘿蔔素合成基因簇，在大腸桿菌菌株JM101中共表達，與不具有外源IPI基因的菌株相比較，番茄紅素的產量增加了3.6～4.5倍。Farmer等[20]將MEP途徑中的Pps(磷酸烯醇丙酮酸鹽合成酶基因)過量表達來合成番茄紅素，使番茄紅素的產量提高了5倍。

革蘭氏陰性菌可以大量合成法尼基二磷酸(FPP)和少量的甲基辛烯二甲基辛烯焦磷酸(GGPP)，通過向菌體中引入氂牛兒基氂牛兒基焦磷酸合成酶可以促進FPP向GGPP的轉化，GGPP是合成番茄紅素的直接前體，因此可利用合成FPP的菌株導入外源限速酶基因提高番茄紅素的產量，Misawa等[21]將攜帶有3個歐文氏菌番茄紅素合成基因的質粒pACCRT-EIB(載有crtE、crtB、crtI)，在大腸桿菌菌株JM101中表達，番茄紅素產量達200～500μg/g(干基)。Kajiwara等[19]發現並證實IPP轉化為DMAPP是萜類物質合成的限速步驟，增加IPP異構酶基因(idi)表達可提高類胡蘿蔔素的產量。

2.4 阻斷競爭性分支途徑

三孢布拉黴菌生產β-胡蘿蔔素已經實現工業化。如圖1所示，β-胡蘿蔔素是由番茄紅素經番茄紅素環化酶(lycopenecyclase)環化形成。所以通過基因突變、基因敲除、基因干擾等方法阻斷β-胡蘿蔔素生物合成途徑中最後兩步環化反應，也可積累產生番茄紅素，並提高番茄紅素的產量。湯暉等[22]通過重疊延伸PCR的方法克隆了三孢布拉氏黴菌carRA基因，通過構建原核表達載體pET28a-carRA，分別驗證了番茄紅素環化酶及八氫番茄紅素合成酶功能活性，為定點突變番茄紅素環化酶活性位點而不影響八氫番茄紅素合成酶功能活性提供了篩選模型。LiYe等[23]採用實驗設計(ED)和人工神經網絡(ANN)相結合的方法優化了在三孢布拉黴菌中PCR擴增番茄紅素環化酶carRA基因的方法，實現了Real-time PCR技術定量分析carRA基因，目前通過這種途徑構建的工程菌尚未見報導。



3·番茄紅素髮酵生產工藝

微生物發酵生產番茄紅素，具有很好的發展前途，受到各國研究人員的重視。近年來，研究人員對利用微生物發酵生產番茄紅素方面進行了大量研究，涉及微生物包括了細菌、黴菌、酵母等。創造出了一些新的番茄紅素髮酵生產工藝，為提高番茄紅素產量及降低生產成本提供啟示。

目前，三孢布拉氏黴菌是唯一能夠實現β-胡蘿蔔素工業化生產的高產菌株，番茄紅素作為其代謝中間產物，研究重點在於如何通過條件優化及加入阻斷劑打斷番茄紅素向β-胡蘿蔔素轉化的環化反應，使番茄紅素在細胞內大量積累。阻斷劑可以與生物合成β-胡蘿蔔素過程中的環化酶結合，從而使環化酶喪失活性，無法與番茄紅素結合，阻斷了生成β-胡蘿蔔素的反應，使得最終產物停留在番茄紅素的階段，從而大量積累番茄紅素。目前所用的阻斷劑主要有兩類，一類為叔胺類化合物，如：對二甲氨乙基苯酚、三乙胺、2-二甲氨基乙苯、2-二甲氨基乙苯等；另一類為含氮的雜環化合物，如：菸鹼、砒啶、菸草廢棄物、哇琳和某些取代衍生物。

Choudhari等[24]研究幾種化學阻斷劑如咪唑、吡啶、三乙胺、哌啶、煙酸對番茄紅素髮酵的影響，發現在含有充維生素A醋酸酯的發酵培養基中添加500mg/L 哌啶，番茄紅素產量提高7.76倍，達到了775mg/L。Wang Jingfeng等[25]對三孢布拉霉NRRL 2895(+)和NRRL2896(-)搖瓶生產番茄紅素髮酵工藝進行了系統優化，研究發現正、負菌株的比例、番茄紅素環化酶抑制劑砒啶和肌酐、三孢酸結構類似物脫落酸、3-羥基-3-甲基輔酶A(HMG-COA)前體物亮氨酸以及甲羥戊酸激酶激活劑青黴素是影響番茄紅素合成的關鍵因素。在最佳的發酵條件下，即發酵液中正負株的最佳比例為5:1，發酵過程中添加6g/L肌酐、0.1g/L青黴素、150μmol/L脫落酸及0.5g/L的亮氨酸，番茄紅素產量可達(156.2±15.4)mg/L，比優化前提高了134.9%。

Liu Xiuji等[26]研究了7.5～200L發酵罐生產番茄紅素髮酵工藝，發現溶氧張力，pH值，機械攪拌的剪應力是影響三孢布拉霉NRRL 2895(＋)和2896(-)發酵生產番茄紅素的關鍵因素，在發酵的第3天加入150μmol/L脫落酸，第4天加入0.5g/L的亮氨酸和0.1g/L的青黴素，番茄紅素的產量達到270.3mg/L。

三孢布拉氏黴菌屬於高度嗜氧嗜黏度的微生物，因培養基中常使用澱粉、糊精等增稠劑，導致培養基黏度大、固型物含量高，致使發酵系統的溶氧速率降低，菌體生長過程中容易糾結成團，導致對數生長期溶氧量遠遠不夠。提高攪拌轉速能夠在一定程度上提高溶氧速率，但高攪拌轉速形成的高剪切力，使得菌體受損，生物活性降低致使生物量減小，僅單純加大通氣量，在發酵處於對數生長期時，仍然達不到要求。王常玲等[27]考察了幾種初級代謝中間產物對三孢布拉霉發酵生產番茄紅素的影響，以及卵磷脂對三孢布拉霉正負菌接合孢子及發酵的影響，研究發現添加2.0%檸檬酸和2.0%三孢酸，番茄紅素的產量分別達到0.99g/L和1.26g/L，比對照分別提高39.43%和32.63%，當大豆卵磷脂的添加量為0.3%時，番茄紅素的產量為1.58g/L，比對照提高56.44%，卵磷脂的添加能促進三孢布拉霉兩性接合孢子的形成，進而促進番茄紅素的合成。Alper等[28]研究兩株重組大腸桿菌，發現較高的氧含量及pH值有利於細胞高密度發酵，在最佳的操作條件下番茄紅素的產量達220mg/L，是目前報導的大腸桿菌最高產量。解書懷等[29]考察了代謝途徑中關鍵酶活促進劑對番茄紅素髮酵的影響，通過添加代謝途徑中HMg-CoA還原酶與MVA激酶酶活促進劑，提高類胡蘿蔔素前體物質的生物合成，從而促進三孢布拉黴菌合成番茄紅素的能力，添加青黴素、β-紫羅酮等物質，番茄紅素最大產量達到1.54g/L。也有學者對結冷膠的發酵動力學和代謝途徑進行了分析，並採用中心複合法等方法改進工藝提高產量。萬紅貴等[30]用中心複合法對三孢布拉霉發酵產番茄紅素條件進行了優化，使發酵培養基中番茄紅素含量達到0.7623g/L，比初始番茄紅素產量提高了30.31%。朱博斐等[31]以Blakesleatrispora為生產菌，研究了番茄紅素的發酵動力學，通過各自的模擬方程預測出菌體生長量、產物生成量以及葡萄糖的消耗量，為工業放大生產番茄紅素提供了理論依據和方法。

目前，生產天然類胡蘿蔔素的主要菌種為三孢布拉氏黴菌和紅酵母，紅酵母的研究尚處在實驗室小試研究階段，色素生產水平比三孢布拉氏霉低很多，具有營養要求簡單、培養周期短、菌體可綜合利用、高密度液體發酵過程易於產業化等優點，近年來紅酵母作為番茄紅素產生菌備受關注。王婧等[32]研究了碳源、氮源、發酵時間、阻斷劑、MgSO4、過氧化氫對菌體產番茄紅素的影響，得到紅酵母產番茄紅素的最佳發酵條件，番茄紅素最高產量為6.8mg/L。王海兵等[33]研究菸鹼、過氧化氫這兩種效應物對紅酵母發酵累積番茄紅素的影響，發現其加入的劑量和時間對累積量影響顯著，在紅酵母發酵至36h時，同時加入2.5mL/L菸鹼和1.6mL/L雙氧水(含30%過氧化氫)，可使番茄紅素得到大量的積累，達到86.88mg/L，番茄紅素產量是不加菸鹼和過氧化氫時的21.2倍。王海兵等[34]基於紅酵母中類胡蘿蔔素的合成途徑，發現添加2.5ml/L環化抑制劑菸鹼、400mg/L麥角固醇合成抑制劑酮康唑、4mg/LMVA(3-甲基-3,5-二羥基戊酸)激酶的激活劑青黴素、1.2ml/L氧化劑過氧化氫等代謝調節物可以促進黏紅酵母中番茄紅素的累積，可以使番茄紅素累積量達到176.97mg/L，是未用代謝調控時番茄紅素產量4.10mg/L的43.2倍。

4·展 望

番茄紅素作為一種功能性天然色素，具有淬滅活性氧、消除人體自由基、預防心臟病、減緩動脈粥樣硬化、預防多種癌症、保護心腦血管、抗老化、保護皮膚等生理功能，具有廣泛的應用前景和較高的商業價值。近年來，番茄紅素相關產品的開發已成為國際上功能食品和新藥研究的熱點，備受關注。番茄紅素產品主要應用於食品添加劑、天然著色劑、化妝品等行業。目前國內市場上此類產品的品種和數量都十分稀少，截至目前國家食品藥品監督管理局正式批准的番茄紅素保健食品共計22個，遠遠不能滿足市場需要。因此關於番茄紅素的製備及其系列產品的開發，對增強國民健康水平和發展我國的食品工業具有十分現實的意義。

因番茄紅素純品價格昂貴、穩定性差、成本較高等問題，導致其應用受到了極大限制。因此降低生產成本、提高番茄紅素產量一直是微生物發酵生產番茄紅素研究的關鍵。番茄紅素的生物合成途徑已基本清晰，可以通過基因工程手段，為微生物提供充足的番茄紅素合成前體，並利用遺傳工程和代謝工程阻斷番茄紅素環化，使番茄紅素在細胞中得到最大積累。國內在番茄紅素研究方面起步較晚，今後隨著在番茄紅素抗癌、防癌、抗氧化作用機理等領域進一步深入研究，番茄紅素必將成為第4代保健食品中令人矚目的新星。

參考文獻：略