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声明  近日，Wiley Interdiscip Rev RNA发表了西班牙巴塞罗那科技研究所的基因组调控研究中心的Gian G. Tartaglia教授与同事撰写的综述文章，系统汇总了RNA结合蛋白研究技术的主要进展(Marchese et al., 2016)。 文中作者分别从以蛋白为核心的研究技术，以RNA为核心的研究技术，未来仍面临的技术挑战，信息分析技术和未来挑战以及RNA结合蛋白复合物（RBP）组装研究技术与挑战等方面分别讨论了RNA结合蛋白的研究技术进展(Marchese et al., 2016)。下面就让我们一起学习一下文中讨论到的RNA-蛋白相互作用研究技术吧： 中心法则的确立大大推进了现代分子生物学的发展，RNA作为中心法则中最关键的要素之一，一直受到学术界的高度关注。目前已发现了种类繁多，功能多样化的RNA，包括传递遗传信息的mRNA，负责翻译蛋白的tRNA和rRNA，以及发挥特殊调控功能的细胞核小RNA（snRNA），micro-RNA，ncRNA（包括环状RNA，circRNA），PIWI-interacting RNA（piRNA）等等。到目前，RNA的功能已经远远超出了作为遗传信息传递中介的作用，很多类型的RNA分子直接可以发挥功能。RNA发挥功能的过程中，与靶分子的结合是关键的一步。如何分析鉴定到真实的RNA与蛋白的相互作用是探索RNA功能的关键。 图1 RNA细胞生物学作用概览 （来自(Marchese et al., 2016)） 以蛋白为核心的研究技术 通过蛋白研究相互作用的RNA分子是常用的研究RNA与蛋白相互作用的思路。目前已发展出多种这类的研究技术，包括适合体内（in vivo）研究的RIP（RNA immunoprecipitation）和CLIP（cross-linking and immunoprecipitation）技术及其各种衍生技术（例如HiTS-CLIP，PAR-CLIP，iCLIP，eCLIP等），适合体外（in vitro）的RNA-compete，SEQRS（in vitro selection high-throughput sequencing of RNA and sequence specificity landscape），RBNS（RNA Bind-n-Seq），RNA-MaP（Quantitative analysis of RNA on a massively parallel array），HiTS-RAP（high-throughput sequencing RNA affinity profiling），MITOM（RNA mechanically induced trapping of molecular interactions）等。文中详细介绍了这些方法的优缺点。汇总为表格：
RIP是最常见的基于蛋白研究RNA-蛋白相互作用的技术，该技术是全基因组水平的检测技术，但由于实验过程中用到的裂解条件等条件与生理条件有差别，因此很容易出现假阳性和假阴性的结果，RIP实验获得的结果往往需要进一步的验证。 RIP实验的这一不足可以通过基于交联的技术体系纠正，也就是CLIP实验。CLIP实验基于交联条件，将生理条件下有相互作用的RNA与蛋白交联在一起，在通过SDS-PAGE等技术分离RNA样品，可进一步通过测序等技术进行进一步的鉴定。根据实验条件和产物鉴定程序，CLIP实验技术细分为多种：如果获得的RNA样品反转录后进行深度测序，称之为HiTS-CLIP（high-throughput sequencing of cDNA library），基于光激活核苷的增强型CLIP，PAR-CLIP（Photoactivable ribonucleoside enhanced CLIP），单核苷酸分辨率的CLIP，iCLIP（individual-nucleotide resolution CLIP），优化的CLIP，eCLIP（enhanced CLIP）。HiTS-CLIP的优点是可以全基因组水平的筛选鉴定，不足是会因为交联条件限制而出现假阴性结果。PAR-CLIP的分辨率很高，但非常耗时间。iCLIP的分辨率很高，但实验技术操作要求非常高。eCLIP通过改善实验流程，在不降低CLIP的碱基分辨率精度下简化了实验耗时。目前已有102项eCLIP的报道，涉及73种RNA结合蛋白。值得一提的是CLIP利用紫外进行交联局限性非常明显，目前已知只有大约1-5%的RNA与蛋白结合的情况能够被紫外线成功交联，具体如何交联的目前也还不完全清楚。 体内研究RNA-蛋白相互作用往往受到细胞类型和细胞生长状态等因素的影响。体外鉴定RNA-蛋白相互作用则不受此限制。目前已发展了多种体外高通量筛选RNA-蛋白相互作用的技术方法。如将目标蛋白固定于支持相，高通量筛选各种突变型的RNA分子，获得最佳结合能力的RNA分子信息，这类方法包括利用荧光标记的RNA探针进行竞争性结合后杂交鉴定的RNA-compete技术，捕获的RNA分子进行高通量测序的SEQRS技术（selection high-throughput sequencing of RNA and sequence specificity landscape），RBNS技术（RNA Bind-n-Seq）等。还有一类可以定量分析RNA-蛋白相互作用的技术方法，包括RNA-MaP技术（massively parallel array），HiTS-RAP技术（high-throughput sequencing RNA affinity profiling）及RNA-MITOMI技术（RNA mechanically induced trapping of molecular interactions）等。体外研究RNA-蛋白相互作用的优势是可以实现高通量分析，但这类分析的实验条件往往与生理条件存在差别，不能完全反映生理状态下的相互作用。
以RNA为核心的研究技术 以RNA为核心的RNA-蛋白相互作用研究技术主要用于分析鉴定与目标RNA分子相互作用的蛋白分子。体外基于RNA研究RNA-蛋白相互作用的方法主要通过将目标RNA分子加标签进行，标签可以是生物素，荧光染料，也可以是一些颈环结构的Tag（如S1，D8，MS2等），例如TRAP，RAT，RaPID，Ribo-Trap，RNase-assisted RNA chromatography等。MS2颈环结构还可用于体内的研究，MS2与靶RNA分子融合表达，噬菌体MS2结合蛋白与蛋白标签融合表达，可以用蛋白标签的抗体将MS2标签RNA分子IP下来，进而可以实现RNA相互作用蛋白的分析鉴定，此技术称为MS2-BioTRAP。MS2-BioTRAP技术在野生型RNA分子基础上增加了MS2标签，可能会影响RNA的二级结构，这些RNA和蛋白的表达也会存在细胞类型的局限。
在体内基于RNA研究RNA相互作用蛋白的技术也有多种，例如通过交联反应将RNA与相互作用蛋白交联于RNA分子上，再基于反义生物素标记标签进行钓取纯化的CHART技术（Capture hybridization analysis of RNA targets）和ChIRP技术（Chromatin isolation by RNA purification），基于反义RNA进行纯化的RAP技术（RNA antisense purification）等。这些技术都已成功运用于非编码RNA的研究中。
RNA-蛋白相互作用研究技术的主要问题与发展趋势 虽然已经发展出了一系列的研究技术，但任何一项技术都或多或少的存在不足因素。由此衍生的两个重要问题：1. 体外鉴定的RNA-蛋白相互作用究竟多大程度反映了体内的情况？2. 有相互作用就意味着有功能吗？有鉴于这一系列问题，还有待进一步开发新的RNA-蛋白相互作用的研究技术。 RNA-蛋白相互作用的信息学预测分析技术 随着一系列的RNA-蛋白相互作用不断被发现，基于此开发的一系列信息学预测技术也得到了长足发展。基于已知的RNA-蛋白相互作用中RNA序列特征进行预测的工具包括MEME，RBPmap，SeAMotE，RNAcontext等。还有一类通过分析蛋白表明结构特征预测能否结合RNA的，这类工具包括Struct-NB，PRIP，SPOT-Seq，OPRA等。 基于机器学习的新型预测算法也取得了一些进展，所用到的机器学习算法包括SVM（Support Vector Machine），RF（Random Forest）及NB（Na?ve Bayes）等，例如BindN，Pprint，RNAProB，RNABindR等，这几个算法基于单个氨基酸的预测分析。HMMER则基于序列同源性进行预测分析。最新报道的catRAPID signature在更进一步，还会基于目标分子的亲水性和二级结构等信息综合进行预测分析。
总之，RNA-蛋白相互作用的研究技术依然还处于不断发展完善的阶段，各位如果有对此感兴趣的，建议在条件允许的情况下设计多种鉴定实验相互验证。在接下来的几期中，我们将穿插着分别介绍常用的RNA-蛋白相互作用研究技术，请大家留意关注。 参考文献：
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