宏基因组找不出来的代谢通路，代谢组可以！

2017-03-07 

小知识：石油管道的腐蚀一般可分为内部腐蚀与外部腐蚀，内部腐蚀又分为微生物腐蚀、电化学腐蚀等多种腐蚀类型。在原油运输过程中，油管内部一般是无氧环境，因此厌氧细菌是主要的活动群落。

硫酸盐还原菌、硝酸盐还原菌和部分产甲烷古细菌是参与微生物管道腐蚀的重要菌落。厌氧的硫酸盐还原细菌的代谢作用所产生的硫化氢与铁离子反应而使阳极去极化：HS＋Fe^2＋= FeS＋2H^＋ 从而促进了腐蚀。

同时，由于石油管道中存在大量碳水化合物，这会促进产甲烷古细菌等消化C的厌氧微生物生长。它们的活动能通过摄取阴极氢而促进腐蚀反应的阴极去极化，从而加快铁腐蚀。然而，另一类利用N作为终端电子受体的厌氧微生物——硝酸盐还原菌，能够与硫酸盐还原菌共同竞争电子，从而降低硫酸氢的产生，起到减轻腐蚀的作用。

总体来说，研究人员认为，油田中产生甲烷的细菌和硫酸盐还原细菌的活动都促进金属设备的腐蚀，而硝酸盐还原菌则能起到抑制腐蚀效果。

研究背景

管道腐蚀对石油工业造成严重的影响，它可引发石油泄漏，从而造成庞大的经济损失和严重的生态环境污染。微生物是造成管道腐蚀的其中一个重要因素，其中与硫还原相关的微生物更是起主要作用。前期研究已有报道说微生物群落的物种以及基因差异会引起腐蚀速度的差异，但却还没有明确阐明其机理，因此通过此研究挖掘微生物在管道腐蚀中的作用。

样本处理

作者针对腐蚀较快（high corrosion，HC）和较慢（Low Corrosion，LC）的两个管道，采集第3次（HC3和LC3）和第11次（HC11和LC11）的清管渣滓物分别进行16S测序、宏基因组测序和代谢组测序。其中代谢组样本设计每组三个重复。

技术路线

主要研究结果

1

16S测序研究群落物种差异

由于腐蚀较快和较慢的管道所经历的物理-化学环境基本一致，因此作者猜测造成它们腐蚀速度差异的原因在于微生物的影响不同。作者首先利用16S测序，比较两种管道中的微生物生长情况，发现LC组中主要以硝酸盐还原的假胞单菌为主要成分（图1蓝色框），而HC组中，则含有大量的硫酸盐还原细菌和产甲烷古细菌（图1红色框）。

图1. 群落物种鉴定情况

2

宏基因组COG基因功能分析

通过16S测序发现两个组的微生物组成存在极大差别之后。作者通过宏基因组测序获得群落中的功能基因序列，然后利用COG分析，发现与甲烷产生途径相关基因主要集中在HC组中（图2A），而LC组则以氮循环为主要功能（图2B）。

值得注意的是，虽然HC和LC组都存在多种的硫循环途径（图2C），但由于LC组中的这些硫循环COGs主要集中在Gammaproteobacteria中，而Gammaproteobacteria并没有被报道过有硫酸盐还原功能，因此作者认为LC组中的硫循环COGs只是因为其他蛋白的同源性而产生，并不具有实际功能作用。

图2. COG功能分析结果

3

宏基因组代谢通路研究

在获得群落的大致功能情况后，由于群体中有相当一部分优势菌，因此利用宏基因组重组细菌基因组后，发现LC组中的优势菌主要以氮循环作用为主，而硫循环作用则在两组中都存在。虽然分析显示两组都能进行硫还原作用，但具有这种功能的微生物在HC组中占有很高比例（34%），而LC组则只有1.6%左右。这都表明LC组中的微生物更倾向于进行硝酸盐还原，而HC组的则更多开展硫循环（图3）。

同时，鉴于原油管道中含有大量的碳水化合物物质，通过对两组微生物的碳水化合物功能分析发现，LC组中具有更多的有氧性碳水化合物消化功能，而两组都极少有厌氧性碳水化合物代谢基因存在。

图3. 优势菌中S和N功能比较

4

代谢组分析

由于宏基因组数据显示两组都几乎没有厌氧性碳水化合物基因存在，因此作者通过代谢组研究，进一步去解释这种与原假设不符的原因。清管残渣不单含有微生物代谢物，还有石油成分、管道金属离子、保护剂等各种物质，因此其化学成分极其复杂，因此首先定位于能够把多个组分分开的代谢物质。

通过分析发现，有多种物质（5465种）能够把各个组分区分开（图5）。在这些组分当中，有2352种能够在KEGG通路中被发现。通过进一步的碳水化合物代谢物分析发现，多种与厌氧型碳水化合物相关的代谢产物（如succinic acids）存在于HC组分当中（图6），表示HC组微生物具有厌氧性代谢碳水化合物能力。这个结果是对宏基因组分析的有力补充。

图4. 基于代谢物的PCA分析

图5. HC和LC组中与碳水化合物代谢相关的重要代谢物

文章总结

文章通过16S测序找出不同腐蚀速度的石油管道中存在微生物群落差异，并进一步通过宏基因组测序分析，从功能上发现这些差异的物种存在硫循环以及氮循环上的极大差异。利用宏基因组虽然从理论上没有发现HC管道中的微生物存有厌氧性碳水化合物的代谢证据，但通过代谢组数据的补充，从终端代谢物层面，发现HC管道的微生物确实进行一定量的厌氧型碳水化合物代谢。从而利用16S测序、宏基因组测序和代谢组测序，一步步深入发现HC管道的腐蚀较快与管道中存在的硫酸盐还原菌和厌氧型产甲烷古细菌有关，而LC管道中由于存在大量的硝酸盐还原菌活动，极大地抑制了管道的腐蚀化学反应。

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参考文献：

[1] Bonifay, Vincent, et al. 'Metabolomic and Metagenomic Analysis of Two Crude Oil Production Pipelines Experiencing Differential Rates of Corrosion.' Frontiers in Microbiology 8 (2017).