治疗性单抗的亚型选择与Fc区域改造

babyface13ghu9 2017-03-21

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前言

如今，治疗性单克隆抗体已成为一种应对癌症及自身免疫疾病的重要治疗手段。单抗的功效不仅依赖于其抗体结合区域(Fab)，同时其可结晶区域(Fc)也发挥着重要作用。Fab能够特异地识别肿瘤相关抗原(TAA)，从而调控TAA相关的下游信号通路。Fc能够发挥一系列效应功能如ADCC、ADCP和CDC，进一步提升单抗的功效，同时Fc还能结合FcRn从而延长单抗药品的半衰期。在现在已批准的单抗中，绝大部分都是使用的未经改造的IgG1亚型，随着对单抗药效要求不断提高，选择合适的IgG亚型以及Fc区域改造是当今单抗研发的一个热点。

Fc区域相关的生物学功能

IgG分子的Fc区域能发挥一系列生物学功能进一步提升单抗功效。Fc能够结合FcγRs，FcγRs主要表达在各类免疫白细胞上，当这类细胞被招募和激活，能引发抗体依赖细胞介导的细胞毒作用(ADCC)以及抗体依赖细胞介导的吞噬作用(ADCP)，从而清除目标肿瘤细胞。Fc也能够结合血清补体分子(C1q)，继而形成膜攻击复合物(MAC)清除目的细胞，这一过程被称为补体依赖的细胞毒作用(CDC)。Fc区域还能够以PH依赖的方式结合新生的Fc受体(FcRn)，避免抗体被细胞核内体降解，从而延长单抗的半衰期。

▲Fc区域功能示意图：（A）ADCC，（B）ADCP，（C）CDC，（D）FcRn与Fc的结合

在人体中有四类IgG分子的Fc受体：FcγRI(CD64), FcγRII(CD32 a,b,c), FcγRIII(CD16 a,b,c)以及FcRn。其中FcγRI, FcγRIIa, FcγRIIc和FcγRIIIa能够通过其IMAM激活序列刺激免疫效应细胞激活，从而引发ADCC和ADCP。对应的，FcγRIIb包含一个ITIM抑制序列，从而抑制炎症反应。

除了FcγRI，其他的Fc受体与IgG分子都只有较低的亲和力(>1μM)。在体内，只有FcγRI能够结合单体IgG分子，而其他低亲和力的FcγRs不能。但是它们对多价的免疫复合物有着很高的亲和力，从而引发下游的信号通路。

Fc对于FcγRs/C1q和FcRn的结合位点不同，其中FcγRs/C1q结合位点位于铰链区与CH2交界处，而FcRn结合位点位于CH2与CH3交界处。这为在不影响抗体半衰期的情况下改造Fc与FcγRs/C1q的亲和力提供了条件。

▲IgG分子结构示意图以及与FcγRs/C1q，FcRn的结合区域

IgG家族分类及特点

IgG家族包含四个成员，IgG1-4，它们有着不同的铰链区，在Fc domains上也存在一些氨基酸的差异。它们与FcγRs的亲和力各不相同，因此功能上也有差异。

▲IgG1-4分子铰链区序列对比

IgG1是人体内最多的亚型，也是单抗药物中用的最多的亚型。IgG1能够结合各种FcγRs，能够引发ADCC，ADCP以及CDC效应。IgG2的铰链区比较短且不灵活，且其与FcγRs的亲和力最弱，但是IgG2仍能够通过与FcγRIIa的结合引发单核细胞介导的ADCC与巨噬细胞介导的ADCP。此外，IgG2的铰链区上游存在额外的Cys残基，因此会形成二硫键异构体影响IgG2分子的空间构象与功能。IgG2分子的铰链区对于蛋白酶切割是稳定的。IgG3有一个延长的铰链区域，其核心铰链区有11对二硫键，因此对于蛋白酶切割不稳定。IgG3与FcγRs的结合能力最强，能引发ADCC和ADCP，且CDC效应比IgG1更强。IgG3的半衰期更短，其R435不同于其他IgG分子的H435，影响了其与FcRn的结合。IgG4分子的铰链区较短，且其与FcγRI之外的FcγRs结合较弱。IgG4分子不能引起CDC和NK细胞介导的ADCC，但是能引起巨噬细胞介导的ADCP。在体内，IgG4分子会经历Fab-arm交换的过程，从而形成半分子以及双特异的功能单价的抗体。S228P能够稳定IgG4分子，阻止半分子的形成。

▲IgG亚家族分子性质对比

到目前为止，由于IgG3的半衰期短，且铰链区易被加工，没有被批准的单抗采用的是IgG3骨架。对于一些纯拮抗作用的抗体，如可溶性细胞激素如TNFα，IL17A等，或者免疫检查点如PD-1的抗体来说，并不需要FcγRs带来的效应作用，且能够防止ADCC等带来的细胞毒性，因此Fc效应弱的IgG2和IgG4被选择用来作为骨架。现在已有4个IgG2和6个IgG4单抗被批准上市。随着最近的重磅药anti-PD1单抗nivolumab和pembrolizumab，anti-IL17A单抗ixekizumab以及anti-PCSK9单抗evolocumab都采用了IgG2或IgG4亚型，这些亚型的开发会受到追捧，但仍需处理好IgG2二硫键异构体以及IgG4不稳定等问题。

▲已上市的IgG2与IgG4亚型抗体

此外，一个新型的概念cross-subclasses也被提出用于改造抗体。Kelton等构建了一个IgG1嵌合体，其中IgG1的CH3结构域及CH2α1 loop残基245-258(PKPKDTLMISRTPE)被IgA中结构相似的区域所代替，这个IgGA嵌合体对FcγRIa，FcγRIIa以及FcαI都表现出了良好的亲和力，能够非常有效地引发ADCC,ADCP以及激活补体。一个IgG1-IgG3的嵌合体，含有IgG1的CH1区，铰链区以及IgG3的CH2，CH3区，也表现出了大大提高的CDC活性。此外，IgG1与IgG4分子的铰链区都易于被蛋白水解，因此Janssen的一些研究将IgG2的铰链区下游组装进IgG1分子（E233P/L234V/L235A/ΔG236）分子中。由于这样的改变会影响IgG1分子的Fc功能，可进一步通过点突变，如S239D来重塑ADCC活性以及K326A/E333A来重塑CDC活性。

通过Fc区域改造达到预期的功能

在了解了Fc区域发挥的生物功能后，除了对IgG亚型进行更换外，可以对其进行改造，从而满足不同单抗功效的需求。比如提高Fc与FcγRIIa/IIIa的亲和力从而增强ADCC作用或提高Fc与C1q的亲和力增强CDC作用，从而更有效的清除目的肿瘤细胞；提高Fc与FcγRIIb的亲和力来增强免疫抑制作用，因此可用于自身免疫以及过敏原的清除；对于单纯的拮抗抗体，敲除Fc与FcγRs的结合能够避免ADCC等带来的副作用；增强Fc与FcRn的结合能够延长单抗药在体内的半衰期。

▲Fc区域改造策略

刺激免疫系统

通过Fc区域改造，增强Fc与巨噬细胞上的FcγRIIa以及NK细胞上FcγRIIIa的结合，能够更有效地对这些细胞进行招募，从而对肿瘤细胞进行杀伤。Lazar等报道了Fc区域单突变(S239D或I332E)，双突变(S239D/I332E)以及三突变(S239D/I332E/A330L)能够提高Fc对于FcγRIIa与FcγRIIIa的亲和力，其中对FcγRIIIa的亲和力提高到了169倍。经过这些改造的CD19，CD96抗体都表现出了更强的ADCC活性。此外一个点突变G236A能够选择性的识别FcγRIIa而不识别FcγRIIb，因此能够显著提高ADCP活性。G236A与S239D/I332E同时突变能够得到增强的ADCC与ADCP活性。

XmAb5574是一个anti-CD19的抗体，它通过S239D/I332E的改造得到了更强的NK细胞介导的ADCC/ADCP作用，用于治疗CLL，目前正处于一期临床。类似的还有XmAb2513(anti-CD30)，JNJ-56022473(anti-CD123)，PF-04605412(integrin α5β1)以及BI 836826(anti-CD37)。

▲刺激免疫系统的Fc改造

抑制免疫系统

FcγRIIb是唯一一个发挥抑制功能的Fc受体。它通常与其它激活性FcγRs表达在相同的细胞上，对于FcγRIIa和FcγRIIIa的信号起到负反馈调节作用，因此FcγRIIb可应用于自身免疫疾病和过敏疾病的治疗。此外，FcγRIIb是唯一一个表达在B细胞上的Fc受体，因此抗原特异的B细胞能够通过FcγRIIb识别自身抗原与治疗抗体的复合物，从而发挥免疫抑制作用。所以FcγRIIb能作为体液免疫反应的关键检查点，在红斑狼疮（SLE）等疾病中发挥作用。

研究发现Fc改造如S267E/L328F或者P238D都能够提升Fc与FcγRIIb的亲和力100倍以上。XmAb5871是一个人源化的抗体，它的Fc区域经过S267E/L328F改造增强了对FcγRIIb的亲和力，它通过其anti-CD19Fab区域激活FcγRIIb，进而抑制B细胞的激活，且不对B细胞产生细胞毒性。目前正处于I期临床试验治疗SLE。XmAb5871中的anti-CD19Fab片段与前文提到的XmAb5574的anti-CD19Fab完全相同，但是Fc区域两个氨基酸的差异导致了它们不同的功能。此外另一个anti-IgE抗体XmAb7195也采用了S267E/L328F改造，增强了对FcγRIIb的亲和力，它不仅能够中和可溶的IgE，还能够选择性的抑制IgE+B细胞的激活。XmAb7195目前正处于I期临床治疗过敏性疾病。

▲抑制免疫系统的Fc改造

激活补体

Fc与C1q的相互作用是引发CDC效应的关键步骤，由于Fc与C1q之间亲和力较弱，因此可以通过Fc改造得到更高效的抗体。Idusogie等发现K326W，E333S能够分别提高C1q的结合3倍和2倍。Rituximab的Fc进行了K326W/E333S改造后能提高5倍的C1q结合能力与2.3倍的CDC活性。Moore等发现S267E/H268F/S324T的改造也能够提高47倍C1q结合能力与6.9倍的CDC活性。

▲激活补体的Fc改造

糖型改造

人IgG分子的N297位能够发生糖基化，该糖基化对IgG的活性有很大影响。如果该位点糖基化被移除，则会影响CH2上半部分的构象，从而丧失对FcγRs的结合能力，影响抗体相关的生物活性。但是对于纯拮抗作用的抗体，如可溶性细胞激素如TNFα，IL17A等，或者免疫检查点如PD-1的抗体来说，并不需要FcγRs带来的效应作用，且能够防止ADCC等带来的细胞毒性，无糖基化改造（Aglycosylation）会有更好的效果。而且与糖基化的抗体相比，Aglycosylation可以尝试使用细菌表达系统来替代昂贵的哺乳动物表达系统，且避免了糖基化带来的异质性问题。目前已上市的罗氏anti-PD-L1单抗Atezolizumab就采用了IgG1（N297A）来去除糖基化。值得注意的是Atezolizumab仍然采用了CHO细胞表达系统。还有一系列采用N297A改造的单抗正在临床实验中。

虽然Aglycosylation使IgG丧失了对FcγRs的结合能力，但是通过一些改造能使其结合能力回复。E382V/M428I的去糖基化单抗与FcγRI有较高的亲和力，表现出了原抗体所不具备的树突细胞介导的ADCC活性。有报道S298G/T299A/N390D/E382V/M428L的去糖基化单抗对于FcγRIIa亲和力更高，表现出了更强的巨噬细胞介导的ADCP活性。

此外，有许多报道证实了N297糖链上岩藻糖的移除能够显著提高Fc对于FcγRIIIa的亲和力与ADCC活性。因此工程细胞株敲除岩藻糖转移酶fucosyltransferase（Fut8KO）或者过表达β1,4-N-acetylglucosaminyltransferaseIII (GnTIII)被用来生产无岩藻糖（Afucosylation）的单抗。其中mogamulizumab(anti-CCR4，KW-0761)已经在日本上市，obinutuzumab（Gazyva，anti-CD20，GA101）也于2013年被FDA批准上市。关于糖型改造更详细的内容，可参看小编之前的文章《Glycosylation for antibody: sweet or bitter?》。

▲已上市的糖基改造抗体

FcKO突变

除了上述采用IgG2/IgG4，或者无糖基化Aglycosylation来降低FcγRs活性外，一些关键氨基酸的突变也能达到类似的效果，如G236R/L328R或者L234A/L235A。这些FcKO突变能够消除FcγRs的结合而不影响FcRn的结合。

调控药物半衰期

IgG分子能够以PH依赖的方式与FcRn结合从而避免被细胞核内体降解，从而延长单抗的半衰期。因此通过Fc改造增强其与FcRn的亲和力，延长其半衰期，对于改进给药频率，病人的依从性以及成本都有着重要意义。在增强Fc与FcRn亲和力的同时，保持其PH的选择性才能有效地提高抗体的半衰期。在之前的一个研究中，Genentech/Roche发现N434W在PH 6.0和PH 7.4条件下，都能够增强FcRn的亲和力，但是半衰期没有改善。然而N434A能够选择性地增加FcRn在酸性条件下的亲和力，因此其半衰期延长了2.3倍。此外，还有研究发现M252Y/S254T/T256E，M428L/N434S或者T250R/M428L都能够延长抗体在灵长类动物中的半衰期。