奥美沙坦对心肌肥厚大鼠炎症因子表达的影响*

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·论著·

奥美沙坦对心肌肥厚大鼠炎症因子表达的影响*

师振霞1　翟冬枝2　师悦天3　周向东4　邵磊2　胡卫军1　李萍1

(1.河南工程学院校医院普通内科, 河南 郑州 450000;2.郑州大学第二附属医院放射科, 河南 郑州 450000;3.浙江大学生物医学工程与仪器科学学院,浙江 杭州 310058;4.河南胸科医院心内科，河南 郑州 450000)

【摘要】目的　探讨奥美沙坦对大鼠模型肥厚心肌中TNF-α、MMP-3、CRP的表达及心肌重塑的影响。 方法　60只健康清洁2级雄性Wistar大鼠，随机分为对照组、模型组和干预组三组；模型组和干预组大鼠背部皮下注射异丙肾上腺素0.02 mg/(kg·d)，bid；对照组大鼠背部皮下注射1 mL生理盐水,bid；应用10天。10天后干预组用奥美沙坦10 mg/(kg·d) 灌胃，qd，其余两组用1 mL蒸馏水灌胃qd；8周后测定大鼠心肌组织中TNF-α、MMP3、CRP的表达，HE染色比较大鼠心肌纤维化程度。 结果　模型组和干预组心肌纤维化程度明显高于对照组，干预组显著低于模型组(P<0.05)；与心肌组织tnf-α、mmp-3、crp的水平一致。 结论　="">

【关键词】异丙肾上腺素；肿瘤坏死因子；基质金属蛋白酶；C反应蛋白；奥美沙坦

再灌注技术减少了急性心肌梗死患者的死亡率，心肌损伤后脏器和组织代偿以及高血压、冠心病、动脉硬化及糖尿病等诱发的慢性心力衰竭(Chronic heart failure,CHF)的发生率、死亡率呈上升趋势。心肌重构-心室重塑是心肌损伤的基本反应。心肌重塑造成心肌肥厚，心腔扩大，心脏顺应性降低，最终导致心肌衰竭。当前心血管临床及科研的重要问题之一就是解决心肌重塑对人体机能的不利影响。心室重塑时，机体发生一系列的神经体液改变：肾素--血管紧张素-醛固酮系统和交感--肾上腺素能系统活性增高，大量炎性细胞因子异常释放。研究表明，肿瘤坏死因子-α (Tumor necrosis factor-α, TNF-α)、 C反应蛋白(C-reactive protein，CRP)、基质金属蛋白酶-3(matrix metal loproteinase, MMP3)以及其他基因蛋白如血清MMP-10、DPT、MLZE、LTBP-2、IGF-IIR及TSC-22水平的变化趋势与心衰发展不同阶段相一致[1]。研究这些反应的机理，寻找调节这些异常使其恢复正常水平的药物成为目前治疗相应种类疾病的有效途径之一。血管紧张素转换酶抑制剂、β受体阻滞剂分别通过阻断RAS及交感神经系统(SAS)延缓甚至逆转心室重塑已得到证实和公认[2]。临床上把抑制CHF患者体内神经内分泌的过度激活作为治疗的关键[3]。具有抗炎作用的药物是否能够通过抑制炎性细胞因子的表达逆转心室重塑，国内外已经展开研究[4]；他汀类降脂药通过其抗炎作用逆转心室重塑的研究已大量展开。奥美沙坦治疗心衰的作用是否与影响TNF-α、MMPs、CRP表达有关，目前国内外研究较少。本项实验应用异丙肾上腺素作用于Wistar大鼠建立心肌肥厚模型，用奥美沙坦灌胃干预，系统研究TNF-α、MMP3、CRP三种炎性因子的表达水平及其与药物的相关性，并和对照组比较，探讨奥美沙坦对心肌重塑的干预机制。

1　材料与方法

1.1　实验分组　随机将60只健康清洁2级Wistar雄性大鼠[体重(200±50) g]分为对照组、模型组、干预组。用异丙肾上腺素作用于模型组(20只)和干预组(20只)建立高血压心肌肥厚模型，10天后模型建立成功，模型组(18只)和干预组(16只)在建模过程中分别死亡2只和4只。

1.2　药物干预　①对照组每日大鼠背部皮下注射生理盐水1 mL/d，bid；模型组和干预组相同部位皮下注射异丙肾上腺素0.02 mg/(kg·d)，bid，连续注射10天。②10天后干预组大鼠用奥美沙坦10 mg/(kg·d)+蒸馏水1ml灌胃，qd，其余大鼠予蒸馏水(1 mL)灌胃，共8周《奥美沙坦酯，第一三共(上海)制药有限公司，规格：20 mg/片》。大鼠灌胃液中含坎地沙坦2 mg/(kg·d)， 其余组灌胃液中无药物组分。③灌注时间4周。

1.3　用免疫组化法测心肌中TNF-α、MMP3、CRP的表达　第一抗体稀释效价为1∶96，加一抗后，切片置于湿盒内4℃冰箱过夜，阴性对照不加一抗，加正常血清。加入二抗(SP-9000 生物素化标记兔抗鼠IgG)，稀释效价为1∶148，37 ℃湿盒30 min。辣根过氧化酶标记的链球菌卵白素稀释效价为1∶148，37 ℃湿盒30 min。 每次加抗体前均以PBS振荡漂洗5 min，3次，DAB、明及树胶封片后，以光学显微镜观察。

1.4　HE染色比较大鼠心肌纤维化程度

1.5　统计学处理　SPSS软件处理数据，以均数±标准差±s)，多组比较用单因素方差分析，组间两两比较用最小显著性差异(LSD)法，以P<>

2　结果

2.1　三组大鼠实验前后体重比较　标准饲养8周后，三组大鼠麻醉后分组用天平称重，比较体重差异无统计学意义(P>0.05)，见表1。

表1　三组大鼠实验前后体重比较( ±s,g)

Table 1　Comparison of the weight among the three groups

组别n体重(g)实验前实验后干预组18247.5±3.6318.5±17.1模型组16245.7±5.8323.9±15.4对照组20246.4±4.1331.6±12.3

注：比较三组大鼠实验前后体重差异无统计学意义(P>0.05)

2.2　三组大鼠心肌组织中TNF-α、MMP3、CRP的表达比较　8周后,取出大鼠心脏，免疫组化法测大鼠心尖部心非梗死区心肌组织中TNF-α、MMP3、CRP的表达，并与对照组相比，模型和干预组上述指标含量明显增高(P<0.05)，而干预组上述指标均明显低于模型组(>P<>

表2　三组大鼠心肌组织中TNF-α、MMP3、CRP的表达比较

Table 2　Comparison of TNF-α, MMP3 and CRP in myocardiai tissues of ras among the three groups

组别nTNF-α(平均灰度值)MMP3(平均灰度值)CRP(平均灰度值)干预组18127.6±8.5108.9±9.6289.6±41.3模型组16149.1±5.3137.4±12.5351.9±33.7对照组2095.4±7.689.1±13.8326.5±43.2

注：三组大鼠左室心肌组织中TNF-α、MMP3、CRP的含量差异有统计学意义(P<>P<0.05)，而干预组上述指标均明显低于模型组(>P<>

2.3　免疫组化检测TNF-α、MMP3和CRP对比

2.3.1　8周后，取出大鼠心脏，免疫组化法测大鼠心尖部非梗死区心肌组织中TNF-α的表达，模型和干预组TNF-α含量明显增高,干预组该指标含量明显低于模型组。见图1(图中着色重的部分显示平均灰度高)。

2.3.2　8周后,取出大鼠心脏，免疫组化法测大鼠心尖部非梗死区心肌组织中MMP3的表达，模型和干预组MMP3含量明显增高,干预组该指标含量明显低于模型组。见图2(图中着色重的部分显示平均灰度高)。

2.3.3　8周后,取出大鼠心脏，免疫组化法测大鼠心尖部非梗死区心肌组织中CRP的表达，模型和干预组CRP含量明显增高,干预组该指标含量明显低于模型组。见图3(图中着色重的部分显示平均灰度高)。

2.4　HE染色对比　8周后,取出大鼠心脏，对大鼠心尖部非梗死区心肌组织进行HE染色，可见对照组心肌细胞排列整齐，无间质纤维化。模型组心肌细胞排列紊乱，胶原纤维增生，间质纤维化明显，干预组较模型组心肌间质纤维化减轻，见图4。

图1　TNF-α在三组大鼠心肌组织中的表达(IHC×400)

Figure 1　The expression of TNF-αin the three group

图2　MMP-3在三组大鼠心肌组织中的表达(IHC×400)

Figure 2　The expression of TNF-αin the three group

图3　CRP 在三组大鼠心肌组织中的表达

Figure 3　The expression of TNF-αin the three group

图4　HE染色比较大鼠心肌纤维化程度(IHC×400)

Figure 4　The degree of fibrosis

3　讨论

高血压的病因和病理变化呈现多元化复杂化的特征。高血压病造成相关靶器官损伤时急性时相反应蛋白CRP在6～8 h即上升，24～48 h(又有48～72 h的报道)达到高峰；有实验发现在冠状事件及周围血管病的各种高危因素中CRP是独立危险因素，其升高与病情发展密切相关。

高血压病造成靶器官损伤及一系列神经体液改变，心脏代偿心肌重塑最后发展为失代偿的心力衰竭增加致残和致死率；心肌重塑主要病理变化为心腔扩大、细胞肥大而数量减少、心肌间质纤维化，顺应性降低收缩舒张功能障碍，最终致心力衰竭甚至死亡[5]。心肌重塑的一系列分子生物学变化表现在RAAS和SAS活性的增高，大量炎性细胞因子如MMPs/CRP/TNF- α/内皮因子等的异常分泌诸多方面。心肌重塑的多重影响因素中，RAAS系统的作用尤为重要。血管紧张素Ⅱ除直接刺激胶原蛋白沉积于心肌间质，又间接借助一些炎性介质如MMPs促进心肌纤维化。由MMPS及其抑制因子(tissue inhibitor oe matrix metalloproteinases TIMPs)调控的细胞外基质再生及水解的失衡,在心室重塑过程中作用突出，目前发现的MMPs系列因子有几十种之多。研究表明重塑心肌组织中MMPs表达还受TNF-α等细胞因子调控；离体实验证实TNF-α可诱导心肌成纤维细胞MMPs蛋白表达上调及活化[6]。 TNF-α是一种具有多种生物学效应的细胞因子，参与介导一些严重的病理生理过程。在一项针对老年高血压患者的研究中，老年高血压患者血清CRP和TNF-α水平明显升高[7]。目前认为炎症和冠心病关系密切，冠心病也是一种炎症性疾病[8]。TNF-α不仅参与了冠心病、动脉粥样硬化、心肌炎、高血压、心力衰竭的发生和发展过程，而且在冠心病和高血压所致的心力衰竭患者血浆中TNF-α水平随着心功能不全的加重而逐渐增加，动物实验也己证实TNF-α等炎症细胞因子在大鼠心肌梗死后的心肌细胞表达明显升高，参与了梗死后心室重塑的过程[9]。TNF-α等会引起心肌细胞的坏死及启动心肌细胞的调亡，近年研究也表明心肌细胞的调亡在心衰发生发展中发挥重大作用,而且心肌细胞的丧失是心衰走向失代偿的根本原因[10]；同时MMP-9和CRP水平随着心力衰竭程度加重而升高，心力衰竭程度重者MMP-9和CRP水平高于心力衰竭程度轻者；CHF患者血清MMP-9和CRP呈正相关[11]。

RAAS将血管紧张素原经肾素水解形成血管紧张素Ⅰ，再经转换酶转化成血管紧张素Ⅱ，进而作用心血管肾脏等组织器官并刺激醛固酮的合成与分泌，醛固酮促进肾小管离子转运，水钠潴留循环总容量增加，血管收缩血压增高，心脏前后负荷加大，心脏代偿发生心室重构。有研究显示奥美沙坦通过调节大鼠血管紧张素转化酶mRNA、降低血管紧张素Ⅱ活性,改善压力超负荷引起的心肌肥厚[12]。奥美沙坦是奥美沙坦酯口服经小肠壁去酯化后的活性成分，具有高度的选择性，可以和AT1的2个位点结合，一个是-OH组，一个是∝-COOH组，即所谓的“双链占领”，而ARB类的其他药物只与AT1的-OH组结合[13]如坎地沙滩等。奥美沙坦的高度选择性决定了其与AT1的高亲和力和持久稳定的降压作用[14]。

大量实验证据显示奥美沙坦除与AT1结合抑制血管紧张素Ⅱ活性降低血压,尚有其他生物学作用：抗炎症降低血清中TNF-α、 CRP、IL-6、 TGFβ-1等炎症因子、消除自由基抗氧化、抗细胞凋亡等[15]。大鼠实验中,奥美沙坦可防止一氧化氮(NO)这种早期炎症标志物合成从而阻止其引起得心脏纤维化。在动脉硬化模型中,奥美沙坦可缩减主动脉(A)斑块面积并降低其内膜厚度，有研究显示大的颈动脉斑块(>33UL)在治疗102周后明显缩小[16].在EUTOPIA对有关实验的评估中揭示奥美沙坦对于血管的保护作用与降低血浆中骨桥蛋白浓度有关[17]；骨桥蛋白有促进成骨细胞样细胞和成纤维细胞贴附于细胞外基质上的功能[18] ；糖尿病患者服用奥美沙坦后动脉硬化程度降低，而氨氯地平无此作用[19]；COACH有实验证实高血压病人服用CCB类药物(如氨氯地平等)出现外周性水肿概率在联合使用奥美沙坦时有明显降低：单用氨氯地平10 mg水肿发生概率(36.8%)显著高于奥美沙坦/氨氯地平40 mg/10 mg(23.5%)联合使用的发生率[20]；目前有多种试验显示奥美沙坦是一种具有复杂的生物医学效应的ARB类药物。

4　结论

奥美沙坦能降低心肌肥厚大鼠心肌组织中TNF-α、MMPs、CRP水平和多种炎性因子对机体的危害作用,具有抑制或延缓心力衰竭发生的生物学效应。

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Effects of olmesartan on inflammatory factor in cardiac hypertrophy rats

SHI Zhenxia1，ZHAI Dongzhi2，SHI Yuetian3, et al

(1.Department of General Internal Medicine, Hospital of Henan Engineering College, Zhengzhou 450000, China;2.Department of Radiology, The Second Affiliated Hospital of Zhengzhou University, Zhengzhou 450000, China;3.College of Biomedical Engineering and Instrument Science, Zhejiang University, Hangzhou 310058, China;4.Department of Cardiology, Hennan Chest Hospital, Zhengzhou 450000, China)

【Abstract】Objective　To observe the effects of olmesartan on tumor necrosis factor-α(TNF-α),metalloproteinases-3(MMP-3),C-reaction protein(CRP) in cardiac hypertrophy rat. Methods　60 Wistar rats were randomly divided into control group and isoprenaline group. When established as the model, the rats of isoprenaline group were randomly divided into model group and intervention group. Based on standard feeding, the control group was treated with subcutaneous injection of 1ml saline b.i.d.. The model group and intervention group were treated with subcutaneous injection of 0.02mg/kg/d isoproterenol b.i.d.. Then, the intervention group was treated with olmesartan. The rats were killed eight weeks after intragastric administration. TNF-α, MMP-3, CRP, concentration levels, degree of fibrosis in rats were observed. Results　The degree of fibrosis in model group and intervention group were significantly higher than that in control group. The degree of fibrosis, TNF-α, MMP-3 and CRP in intervention group were significantly lower than that model group(P<0.05). conclusion　="" olmesartan="" can="" decrease="" the="" degree="" of="" myocardial="" fibrosis="" and="" improve="" the="" remodeling="" and="" cardiac="" function="" after="" cardiac="">

【Key words】Cardiac hypertrophy; TNF-α; MMPs; CRP; Olmesartan

基金项目：河南省自然科学基金资助项目(142300410010)

通讯作者：周向东，E-mail:[e-mail]

【中图分类号】R 542.2

【文献标志码】A

doi：10.3969/j.issn.1672-3511.2016.08.006

(收稿日期：2015-11-10； 编辑： 张文秀)