尿β

尿β-D-半乳糖苷酶活性检测方法的建立及临床意义探讨

宋云霄1，邬建民2，张建华3，姚莉韵3

（1.上海市徐汇区中心医院检验科，上海 200031；2.上海市杨浦区精神卫生中心检验科，上海200093；3.上海交通大学医学院化学教研室，上海 200025）

摘要：目的 以2-氯-4-硝基苯基-β-D-半乳糖苷（CNP-GAL）为底物，建立测定尿β-D-半乳糖苷酶（GAL）活性的连续监测法，并探讨GAL在肾小管病变早期诊断中的临床意义。方法 基于GAL能催化水解底物生成色原2-氯-4-硝基苯酚（CNP）的原理，对最适pH值、底物浓度、反应时间等条件进行研究，建立用于检测尿GAL的连续监测法，并用该法检测125例肾脏病变（30例继发性肾损伤、36例肾小管肾炎、25例肾癌、34例肾囊肿）患者及80名健康体检者（正常对照组）尿GAL活性。结果 建立了检测尿GAL活性的连续监测法，采用柠檬酸缓冲液为最佳缓冲体系，酶促反应最适pH值为4.8，最适底物浓度为2.0 mmol/L。该法批内、批间平均变异系数（CV）分别为2.44%、4.47%，线性范围为3.2～25.6 U/L，当GAL＜1.6 U/L时不能被检出。继发性肾损伤、肾小管肾炎、肾癌患者的尿GAL活性均明显高于正常对照组（P＜0.05），而肾囊肿患者的尿GAL活性无明显增高。结论 建立的GAL活性连续监测法敏感性高，结果准确，操作简便，可用于肾小管疾病的早期诊断。

关键词：β-D-半乳糖苷酶；2-氯-4-硝基苯基-β-D-半乳糖苷；连续监测法；肾小管病变

β-D-半乳糖苷酶（beta-D-galactosidase，GAL）主要存在于肾小管近端上皮细胞中，能水解β-D-半乳糖苷的末端β-D-半乳糖残基[1]。GAL属细胞溶酶体酶，可从尿中直接排出，当肾脏出现实质性损伤时其呈不同程度增高，能敏感地反映肾小管损伤和继发性肾脏疾病[2]。因此，尿GAL活性测定对各种肾功能损伤的诊断及预后判断有重要的意义。目前，对尿GAL活性检测多采用酶促反应终点法[3]，虽操作简便、重复性好，但因影响因素较多，需设空白，不适合临床对大样本检测的需求。因此，我们以2-氯-4-硝基苯基-β-D-半乳糖苷（2-chloro-4-nitrophenyl-beta-D-galactosidase，CNP-GAL）为底物，采用连续监测法，探索酶促反应的最佳实验条件，建立可用于自动生化分析仪的尿GAL检测方法。

1 材料和方法

1.1 研究对象

选取2014年5月—2015年9月复旦大学附属中山医院肾脏科住院患者125例，其中继发性肾损伤30例（男18例，女12例，年龄35～75岁）、肾小管肾炎36例（男13例，女15例，年龄30～65岁）、肾癌25例（男15例，女10例，年龄40～81岁）、肾囊肿34例（男10例，女14例，年龄43～75岁），均经肾活检病理或电子计算机断层扫描（computed tomography，CT）检查明确诊断。选取同期上海市徐汇区中心医院健康体检者80名作为正常对照组，其中男43名、女37名，年龄20～60岁。

1.2 试剂和仪器

1.2.1 底物 CNP-GAL由上海交通大学医学院化学教研室研制，批号为20150928，经高效液相色谱法（high-performance liquid chromatography，HPLC）检测纯度为99.6%。

1.2.2 柠檬酸缓冲液 100 mmol/L柠檬酸缓冲液，pH值分别为4.0、4.4、4.8、5.2、5.6。

1.2.3 底物溶液 精确称取67.1 mg CNP-GAL，分别溶于100 mL不同pH值的缓冲液中，配制成2.0 mmol/L底物溶液。避光4 ℃冰箱保存。

1.2.4 尿液样本 所有对象均留取新鲜随机尿液，离心5 min后取上清液，4 ℃密封保存。

1.2.5 其他 20.5 U/L GAL标准品购自美国Sigma公司。仪器为BECKMAN-COULTER SYNCHRON LX20全自动生化分析仪（美国Beckman-Coulter公司）。

1.3 方法

1.3.1 GAL制备 将500 g胎盘粉碎至匀浆，用0.1 mol/L Tris-HCl缓冲液（pH值8.0）与正丁醇以80∶20比例混合置匀浆内，搅拌48 h后离心取上清液，倒入透析袋内，置于加入上述Tris-HCl缓冲液的烧杯内，透析至无正丁醇，再将含粗酶的透析袋放入另一烧杯内，加入聚乙二醇6 000 mL浓缩，制成GAL浓缩液，采用标准对照法以GAL标准品定标。

1.3.2 方法原理 底物经尿中的GAL催化水解生成色原2-氯-4-硝基苯酚（2-chloro-4-nitrophenol，CNP），在405 nm处吸光度（A）值增加。采用连续监测法。酶活性以37 ℃时每分钟每升尿GAL催化底物生成1 μmol CNP定义为1个单位（U/L）。本法的酶促反应：

1.4 酶促反应最适条件的建立

1.4.1 最适pH值 按底物浓度为2.0 mmol/L分别配制pH值4.0、4.4、4.8、5.2、5.6的底物缓冲液，在温度37 ℃、波长405 nm的条件下，与浓度为5.3 U/L的自制GAL液反应后分别测定A值并计算酶活性。

1.4.2 底物浓度选择 配制浓度为1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 mmol/L的底物缓冲液（pH值4.8），与5.3 U/L自制GAL液反应后检测A值并计算酶活性。

1.4.3 最适缓冲体系的选择 在pH值4.8的条件下，分别将0.1 mol/L柠檬酸缓冲液（柠檬酸-柠檬酸三钠）、0.1 mol/L醋酸缓冲液（醋酸-醋酸钠）、0.1 mol/L磷酸氢二钠-柠檬酸钠缓冲液与自制GAL液（5.3、10.1 U/L）反应后测定A值并计算酶活性。

1.4.4 酶促反应时间的选择 在其他条件不变的情况下，用浓度为10.1 U/L的自制GAL液与0.2 mmol/L底物反应，从10 s起每隔60秒读取1次A值，直至380 s，绘制反应曲线。

1.5 方法学评价

1.5.1 生化分析仪操作参数 尿液样本30 μL，底物液230 μL，波长405 nm，温度37 ℃，延迟70 s，测定360 s，读取其线性反应速率ΔA/min。酶活性计算公式：

式中ε=4 251，是CNP在pH值4.8、波长405 nm条件下实测的摩尔消光系数值；VT为总反应体积（μL）；VS为样本体积（μL）；L为比色杯光径（0.5 cm）。为消除尿量对酶浓度的影响，临床样本测定结果以酶活性值与同一样本尿肌酐（creatinine，Cr）（g/L）的比值（U/gCr）记录。

1.5.2 精密度试验 配制2.0 mmol/L、pH值4.8的底物缓冲液，加入5.3和17.2 U/L自制GAL液各1份，批内重复测定15次，计算批内变异系数（coefficient of variation，CV）。将样本置4 ℃保存，每天测定1次，连续测定15 d，计算批间CV。

1.5.3 稳定性试验 配制2.0 mmol/L、pH值4.8的底物缓冲液，分别在4及37 ℃条件下每天测定A值，连续测定14 d。

1.5.4 线性范围 取32 U/L自制GAL液，按5∶5、4∶5、3∶5、2∶5、1∶5、1∶10、1∶20比例稀释至1.6 U/L，分别加入2.0 mmol/L、pH值4.8的底物缓冲液，反应后测定A值。

1.5.5 各组尿GAL活性测定 采用本研究建立的连续监测法同时检测各病例组及正常对照组尿GAL活性并作比较。

1.5.6 终点法和连续监测法的相关性比较 取正常对照组及各病例组尿样本5份，分别用终点法GAL检测试剂盒[以邻-硝基苯酚-β-D-半乳糖苷（O-nitrophenyl-beta-D-galactosidase，ONPGAL）为底物]和本法（连续监测法，以CNPGAL为底物）测定同一尿液样本的GAL活性，比较2种方法的相关性。

1.6 统计学方法

采用SAS 6.12软件进行统计分析。数据呈正态分布，以表示，组间比较采用t检验。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 酶促反应最适pH值

在温度37 ℃、波长405 nm的条件下，底物缓冲液的pH值为4.8时GAL活性最高。见图1。

2.2 底物浓度的选择

酶反应最适底物浓度为2.0 mmol/L。见图2。

2.3 最适缓冲体系的选择

在pH值4.8的条件下，最适缓冲体系为0.1 mol/L柠檬酸缓冲液。见表1。

图2 不同浓度底物溶液对GAL活性的影响

表1 不同缓冲体系对GAL活性的影响 （U/L）

0.1 mol/L磷酸氢二钠柠檬酸钠缓冲液5.3 5.3 4.3 4.2 10.1 10.4 9.3 9.4自制GAL液（U/L）0.1 mol/L柠檬酸缓冲液0.1 mol/L醋酸缓冲液

2.4 酶促反应时间的选择

在其他条件不变的情况下，在70～370 s内酶促反应时间与A值的变化呈线性关系，见图3。因此，最适反应时间从加入样本起，延迟时间为70 s，测定时间为6 min，以确保酶促反应的良好线性。

图3 酶促反应时间对A值的影响

2.5 精密度试验

高、低值GAL液批内平均CV为2.44%，批间平均CV为4.47%，符合临床测定要求。见表2。

表2 连续监测法的精密度试验

2.6 稳定性试验

稳定性试验显示4 ℃时A值的变化值（ΔA值）较小，底物较为稳定。见表3。

表3 连续监测法的稳定性试验（ΔA值）

时间（d） 4 ℃ 37 ℃3 0.003 0.003 7 0.003 0.004 14 0.003 0.005

2.7 GAL活性检测的线性范围

GAL活性在3.2～25.6 U/L范围内与A值的线性良好（r=0.991 6），当GAL＜1.6 U/L时，不能被检出。见图4。

图4 连续监测法检测GAL活性的线性范围

2.8 各组尿GAL活性测定

检测80名体检健康者尿液样本，计算酶活性，以GAL（U/L）与尿Cr（g/L）比值表示。男性尿GAL活性为（5.5±2.3）U/gCr，女性为（3.9±1.6）U/gCr，男、女性之间差异无统计学意义（P＞0.05）。以第2.5百分位数～第97.5百分位数得尿GAL参考区间为2.7～6.7 U/gCr。

继发性肾损伤组、肾小管肾炎组和肾癌组尿GAL活性与正常对照组比较差异有统计学意义（P＜0.05、P＜0.01）；而肾囊肿组尿GAL活性与正常对照组比较差异无统计学意义（P＞0.05）。见表4。

表4 各组尿GAL活性检测（U/gCr，

注：与正常对照组比较，*P＜0.05、**P＜0.01

组别 例数 尿GAL正常对照组 80 4.6±1.9继发性肾损伤组 30 15.9±4.7**肾小管肾炎组 36 21.1±5.8**肾癌组 25 9.8±3.1*肾囊肿组 34 5.8±2.1

2.9 终点法与连续监测法的相关性

以终点法检测值为横坐标，本法检测值为纵坐标作图，线性回归分析的r值为0.998 9，显示二者相关性良好，见图5。

图5 终点法和连续监测法检测GAL活性的相关性

3 讨论

GAL为溶酶体酸性水解酶，在肾脏近曲小管含量最多。健康人尿GAL活性一般很低，而当肾组织，尤其是肾小管损伤时，尿中GAL活性明显升高。因此，尿GAL已成为诊断肾小管早期损伤的敏感指标之一[4]。以往测定GAL的方法多为终点法或荧光法[5-6]，但因受设备限制，推广难度较大；或因操作复杂、影响因素多，而难以用于临床上肾小管疾病的诊断。

本研究建立了测定尿GAL活性的连续监测法，并探讨了最佳测定条件。结果显示最佳缓冲体系为0.1 mol/L柠檬酸缓冲液，反应最适pH值为4.8，最佳底物浓度为2.0 mmol/L，反应延迟时间70 s为检测前孵育底物和样本的时间，测定时间6 min内线性良好。批内、批间平均CV分别为2.44%、4.47%，精密度良好。

本研究结果显示，正常对照组尿GAL活性为（4.6±1.9）U/gCr，与文献报道[7]的结果[（3.9±1.9）U/gCr]接近。肾小管肾炎及肾癌患者的尿GAL活性均明显高于正常对照者（P＜0.05、P＜0.01），而肾囊肿患者的尿GAL活性无明显增高。肾炎患者尿中GAL活性升高可能是浸润于局部的炎症细胞及增殖系膜细胞的溶酶体酶释放所致。尿GAL活性在肾癌患者中增高而肾囊肿患者不增高，有助于临床对肾脏肿瘤的鉴别诊断。

糖尿病、高血压引起的继发性肾损伤早期在临床上缺乏明显症状。在糖尿病肾损伤早期，肾小球滤过压增高，滤过膜负电荷减少，使蛋白质滤出增加，溶酶体酶激活，导致尿GAL活性升高[8]。高血压患者由于肾血管调节障碍，引起肾动脉痉挛，肾血流减少，使肾小管出现灶性损伤，也会导致尿GAL活性增高[9]。本研究结果显示继发性肾损伤患者尿GAL活性明显高于正常对照者，说明尿GAL检测可以作为临床上继发性肾损伤的早期诊断指标。

目前，市场上的商品化GAL检测试剂盒是以ONP-GAL为底物的，水解生成色原邻-硝基苯酚后采用终点法测定。本研究建立的连续监测法改用CNP-GAL为底物，水解后生成色原CNP，具有更高的检测敏感性。本研究结果显示以ONPGAL为底物的终点法与以CNP-GAL为底物的连续监测法的相关性良好（r=0.998 9）。本研究建立的连续监测法与终点法相比，无需设空白，能用于自动生化分析仪，具有操作简便、重复性好的优点，更适合临床上大样本的检测需求。

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Establishment on the determination method of urinary beta-D-galactosidase activity

SONG Yunxiao1，WU Jianmin2，ZHANG Jianhua3，YAO Liyun3.
（1. Department of Clinical Laboratory，Shanghai Xuhui Central Hospital，Shanghai200031，China；2. Department of Clinical Laboratory，Shanghai Yangpu District Mental Health Center，Shanghai200093，China；3. Department of Chemistry，Shanghai Jiaotong University School of Medicine，Shanghai200025，China）

Abstract：Objective To establish the continuous monitoring method for urinary beta-D-galactosidase （GAL）activity using 2-chloro-4-nitrophenyl-beta-D-galactosidase （CNP-GAL）as substrate，and to investigate the value of GAL in the early diagnosis of renal tubular lesion. Methods Based on the generation of color substance upon the hydrolysis of substrate into 2-chloro-4-nitrophenol（CNP），the optimal pH value，substrate concentration，reaction time and so on were analyzed. The continuous monitoring method for urinary GAL activity was established. Urinary GAL activities in renal tubular lesion patients（30 cases of secondary renal injury，36 cases of tubal nephritis，25 cases of renal carcinoma and 34 cases of renal cyst） and 80 healthy subjects （healthy control group）were determined. Results The continuous monitoring method for urinary GAL activity was established using citric acid buffer solution. The enzyme optimal pH value was 4.8，the optimal substrate concentration was 2.0 mmol/L，and the within-run and between-run coefficients of variation（CV）were 2.44% and 4.47%. The linear range was 3.2-25.6 U/L，which can not be determined at GAL＜1.6 U/L. Urinary GAL activities in patients with secondary renal injury，tubal nephritis and renal carcinoma were higher than those in healthy control group（P＜0.05），and there was no difference in renal cyst patients. Conclusions The continuous monitoring method for urinary GAL activity has good sensitivity，precision and simplicity，which is suitable for the early diagnosis of renal tubular lesion.

Key words：Beta-D-galactosidase；2-Chloro-4-nitrophenyl-beta-D-galactosidase； Continuous monitoring method；Renal tubular lesion

文章编号：1673-8640（2017）03-0219-05

中图分类号：Q555

文献标志码：A

DOI：10.3969/j.issn.1673-8640.2017.03.015

（收稿日期：2016-07-14）

（本文编辑：龚晓霖）

作者简介：宋云霄，男，1973年生，副主任技师，主要从事临床生化检验工作。邬建民，男，1959年生，副主任技师，主要从事临床生化检验工作。宋云霄和邬建民对本研究具有同等贡献，并列为第一作者。

通信作者：姚莉韵，联系电话：[phone]-776468。