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1、切好的切片最好放在4摄氏度左右冰箱里，抗原较不容易丧失。把要做的切片先分好，做几个抗体可分几盒，还有不正常组织与正常组织要分开。其余做预实验用。 2、选择实验要做的抗体时，要结合他们的正常组织和癌组织的分别表达率。 3、试剂盒的选择可结合生物素强弱的情况。如：肝组织生物素含量高，S-P试剂盒生物素含量也高，故不能配合使用。 4、关于抗体试剂等购买，可多家比较，尽可能询问详细。最好买下该公司的阳性片。切记尽可能不要先付钱，等预实验成功后再付，还有尽可能节省，因为会有太多你意想不到的情况，都是需要花钱解决的。买的量尽可能一次性到位，能省就省，风险大的尽量不要省。若实验过程有问题，大可尽量与该公司技术部联系，寻求解决方案。若是怀疑抗体质量问题，可要求换货，态度要强硬，协议流程一次到位，不可被对方牵着鼻子走，否则最终结果只能是浪费时间。若是抗体浓缩液，个人觉得国内的应该都可以做出阳性来，不是国内买不到的话，可考虑国产的，可便宜很多。 5、每次开始做时，都必须先清点实验的必需品是否齐全。想好可能发生的意外，并先想好补救措施。 6、首次预实验先拿出多张不同的组织切片按最常规的条件进行，若没阳性再拿多张不同组织片（可以与首次相同），条件要适当改进，可先找出一个阳性区域，再深入改进。 7、烤片（单一或综合）程度要适情况而定，可中途拿出甩一甩，尽可能先放在烤箱里烤3小时以上。切勿把片烤得太久了。程度刚好，脱蜡效果才会好。注意做好不同条件的切片标记。注意温度稳定，再烤片。 8、抗原修复与烤片：温度高低，缓冲系统。 9、二甲苯脱蜡，若是天气太冷，可先把二甲苯整罐放进烤箱加热，同时也可把片放在二甲苯里一起加热脱蜡，这样会更彻底，效果会更好，若是天气不会太冷，那还是室温下脱蜡，要不可能会适得其反。时间也是适情况而定。 10、脱水与水化。酒精梯度不同。高低相反。 11、甲醛固定会导致蛋白之间交联及醛基的封闭作用，从而失去抗原性。高压修复，注意稀释比例，修复液为何种（EDTA不可以重新进行利用，可能发生交叉作用），PH值为多少，还有修复方式（直接修复与间接修复，差别：压力和温度关系），不同方法的修复（水煮，微波）。高压锅内压力未降至正常时不可打开，正常后多放会儿，能更好的利用余压，把握程度。若是多次修复，每次都需先把锅内热水倒掉，换冷水，保证条件的可重复性。水煮法，电磁炉功率800W为佳。不可让水蒸发掉太多，保证组织至始至终不会干掉。功率太高，组织会脱落。 12、做的切片量较多时，冲洗擦片顺序很重要，小心PBS与抗体混合。PBS切勿把组织冲洗掉。量少时，孵育盒内先倒点水，防止孵育箱内抗体被蒸发掉。 13、PBS冲洗是为了保护内环境。PBS的PH值为7.1—7.5. 免疫组化染色标记是对生物体组织抗原进行标记，抗原抗体最适合的pH值为7.2~7.6。PBS酸碱度与离子度高低的关系。 14、切片不可拿反，易把组织擦掉，思考解决方法，利用编号。 15、人经常是死在自己的优势上而不是自己的劣势。举例：擦破切片。 16、组织切片始终报纸湿润，不可让其干燥。不可有泡泡。 17、过氧化氢酶孵育过久，会导致组织脱片。 18、在不确定瓶内为何液体时，建议倒掉重装，若是抗体配模糊了，建议重配。抗体稀释技巧。吹打次数，震荡机运用。抗体、试剂，都应放冰上处理，养成习惯。 19、抗体浓度、温度（速度）、时间（反应的量）为IHC三大关键点。 20、抗体反复冻融可使效价降低。抗体要防止污染。不可用塑料保存，塑料可吸附抗体。抗体稀释：应遵循“现用现配”的原则，对于PBS（其他稀释液，注意PH值，PBS为偏中碱性）稀释的抗体最好要当天使用。稀释比例恰好为佳，注意前带和后带效应。 21、抗体、试剂盒（注意种属来源，一抗为rat，二抗一般不提倡抗mouse\rabbit），必需完全覆盖组织，能省尽量节省抗体，不可太死板。 22、灵敏性和特异性是相互矛盾的，不可兼顾。 23、除了抗原修复时间与一抗的孵育条件外，其他因素对实验的结果影响不大，当然试剂与试剂盒不能出现问题，oct-4一抗、试剂盒、DAB都曾出现问题过，故对这些质量有时也要保持一定的怀疑，除非有一定的事实证明不是这些问题。这就需要花一定的时间设计方案进行验证，同时要尽可能应用华罗庚统筹原理设计方案，尽量节省时间。当遇到问题时，需要的是根据已有资料，一步步的分析。 24、过夜时间一般要达到16-24个小时。还有冰箱的过夜温度对非特异性染色结果影响很大。温度越接近4摄氏度，效果可能越好，但阳性强度可能会下降，程度不大。过夜冰箱拿出后要放置孵育箱半小时或置于室温一定时间（45分钟），一抗再冲洗，冲洗要彻底。一般不考虑室温下孵育，温度不稳定。 25、二抗可能出现交叉反应，通过PBS代替一抗，阴性对照试验可进行排除。 26、DAB显色要适情况而定，太久可能造成非特异性染色强。同时要注意DAB为致癌物质，有必要防护。苏木素染色前，要先把氧化膜捞出，要不组织贴上就废了。若是天气太冷，可先把整罐苏木素放入孵育箱里加热，再染色，最好有盐酸分化，细胞质和细胞核能更好的分清楚。染色最好不要把弱阳性细胞给覆盖了。做的量较多时，分批显色。用有阳性的片先显色。 27、细胞核需染色时间较长，细胞浆染色时间较短。 28、染完色后，流水冲洗十分钟很重要，能让细胞镜下形态更好看。 29、吹干封片，封片技巧个人体会讲解，不能有泡泡。若是没封好，可进行二甲苯、酒精脱树胶，吹干再次封片，但镜下效果会明显变差，切记，若没必要，最好不要再次脱胶。标签要贴正，要不会让人笑话。 30、刚封完的载玻片会移动，故还没干看片时，尽量不要碰到盖玻片，可避免树胶溢出，片的整体效果不好。 31、DAB显色需用中性树胶封片，AEC（易溶于有机溶剂）需用水性胶封片。 32、预实验阳性片的选择与标准。所选择的阳性片有可能是中阳或弱阳性，故应取最佳效果（即特异性染色与费特异性染色的综合结果）的条件，而不应执着于要有强阳性。 33、实验中遇到问题，要善于查找文献是否有提到类似情况。充分利用文献。也可咨询各大生物公司的技术指导部，或各大论坛寻找方案，求救。 34、抗体不够用的情况下，原先买的抗体最好不要用完，留做可能需要的验证试验。新的抗体要尽量同公司，同批号。 35、对oct-4做出的效果原因猜想，由于部分细胞核未被切开（虽然厚度已为0.3-0.4mm），且抗体本身浓度不够，导致无法对细胞核进行定位，结果部分癌巢为阴性。抗体为工作液，浓度无法改变，故可以考虑对细胞进行细胞通透，促进抗体对细胞核的定位。背景染色不好，个人觉得为抗体纯度不够，或可能对正常组织更敏感。发现DAB显色时，正常组织着色先于癌组织，这为不正常情况。 |
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