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研究某个 gene 的功能通常要做相关的功能实验，常用的手段有 gain-of-function，涉及 gene 的过表达，在下文中即将讲述；还有 loss-of-function， 通常涉及 gene 的 knock-out 或 konck-down，暂且不提。 今天准备跟大家分享一下如何成功地用传统酶切酶连的方法克隆某 gene 的经验，虽然现在同源重组的方法已经越来越广泛地应用到科研中，属于 technology based innovation，给实验带来极大便利。 但是传统的克隆方法还是占主要地位，尤其是新兴的方法如果要做 gain-of-function 仍然逃避不了克隆 gene 片段这个步骤，打好相关的基础，掌握其中原理才能在各种 tools 出现时及时掌握并灵活应用。 接下来讲述基因克隆的流程： 首先获得某基因的序列 在 pubmed 主页下拉框选定 Gene 或者 Nucleotide，然后在输入框输入基因名称如 Znf516 点击 search 后，进入（如图 1）。
在左边分类 Sequence content 里选择 CCDS（如图 2），在右侧选择种属 Mus musculus（如图 3）， 这样就只会显示此基因的 CDS 结果。而页面加载出来后会有很多 Znf516 相关的信息包括基因名，全称，在 chromosome 上的位置及其相邻的基因有哪些，目前已知的此基因相关文献报道，可以忽略这些信息（当然也可以留意一下自己比较关注的那部分内容），在右侧栏目直接点击 CCDS，这样就进入了一个页面，在页面最下方是这个基因的 CDS 的核苷酸序列及蛋白翻译的序列。 可以将此序列 copy 到 snapgene 软件里即完成步骤一。 用 Snapgene 设计引物
将序列输入 Snapgene 后，Map 图显示如图（图 4），先不用管这个图谱，先点选 noncutters（如图 5）， 找到不会切开目标 gene 的酶 A（比如 XbaI）和 B（比如 EcoRI），且须在将要插入载体的 MCS（多克隆位点）上。 注意：要看清楚载体上 promoter 的方向，将 CDS 正向插入到 promoter 后面的 MCS 中间。想要 snapgene 软件？请在对话框回复基因。 比如说 MCS 上的酶切位点是 ABCDE 五个酶切位点，那么设计引物是必须将 A 酶切位点加在 CDS 上游，B 加到 CDS 下游，不可颠倒。并且，最好保证选择的两个酶切位点在载体上不要相邻，如若必须如此则在切载体时先切割对保护保护碱基要求高的位点（请自行百度 NEB 酶切位点保护碱基，查保护碱基个数及切割效率），再切另一个位点。这样可以提高酶切效率。
这样就可以开始设计引物：用鼠标拖选 Znf516 前 28-25 bp（可以通过页面最下面一排的标题栏选择 Sequence，这样可以看到一个个的核苷酸序列，方便拖选，而且在拖选的时候会显示多少 bp 的序列被选中，GC 比以及 Tm 值，很方便）， 一般 Tm 值为 50-60C 都是可以接受的。点击 Add primer（如图 6）。
这样就跳出提示框，是需要选中序列的 Top strand（正向序列）还是 bottom strand（反向互补序列），对于正向/上游引物，选择正向序列（若是反向/下游引物，选择反向互补序列）。 比如我要设计 Znf516 正向引物，并加 XbaI 的酶切位点，那么如图 7：选择 Insertions 中第二行 site 下拉框中的 XbaI，点击 Insert。即将酶切位点（红色大写字母的 6 位碱基）加到了引物上游（如图 8），一般在酶切位点旁边加保护碱基（NEB 主页有优化的保护碱基序列，初学者可以注意一下，克隆做熟练了发现其实不必如此苛刻。根据 GC 比，如果 GC 比正常 55%，或偏低，加两个 g, 如果高则加若干 t）。
引物的命名应该规范一些这样之后在实验室管理及整理时比较方便，一般如下：酶切位点-种属缩写-基因名-F/R
反向引物设计如图 9。 这样引物这一步骤完成了，送到生工合成即可。我们 Lab 现在统一用 synbio，新兴「国产」公司，价格便宜且态度优良，更可贵的是支持晚上 11：00 下单，想必大多数生物汪都会因此喜欢上它。 寻找合适的模板 找到高表达这个 gene 的 tissue, 在 gene 表达丰度高时后期实验更易成功，这个可 refer 各种 paper, 或者 BioGPS website，非常 powerful。 使用方式大概是：打开网站，输入 GeneX，点选 species, 之后就出来各种细胞系或者组织表达此 geneX 相对量，找到表达 X 高的组织用其的 cDNA 当模板来做 PCR。 如果遇见要 P 组织特异性的 gene 的 variant，那么提高此组织 cDNA 的量或者两轮 PCR（第一轮 P 万后用作模板再 P 一次）都是可行的。
获得目标片段 例如从 forebrain cortex 组织的模板上 P 这个 gene, 我们使用的是 KOD 酶（Takara，日产，酶中「墨渊」）。改变很多 PCR 条件都无法 P 出这个 gene（之所以今天举这个栗子，原因就在于此），后分析发现这个 Znf516 平均 GC 含量 61%，局部的 GC 含量高导致 P 出片段不对。此时师兄光环笼罩，指点小僧道： 加 DMSO 有助于 P 高 GC 的基因，遂悟。我的经验做法是 100ul 体系加 0.8uL。 得到目标序列后，切胶回收（紫外照射对身体尤其眼睛不好，给 DNA 胶插上几个枪头确定坐标，在照胶时注意目的条带的位置，之后再关掉紫外去切胶避免手和胳膊及眼睛被紫外毒害，可谓是「穷苦」实验室首选妙法）。
酶切连接转化 酶切回收片段及载体后，将载体：DNA 片段=1：8 加到连接体系，16 度用 T4 酶连接 15 min，或更久，转化到感受态即可。 鉴定：挑克隆摇菌 如果赶时间的话可以边挑菌边鉴定。用 Taq Premix 做鉴定即可。鉴定完送测菌液。之后找公司索要正确序列对应的质粒，至此就得到了您想要的克隆。 最后可能会遇见的问题，在实验过程中如果遇见要构建的蛋白没有很好用的抗体，或者做体外 co-IP 等相关实验，需要构建一个融合蛋白，方便之后用 tag 检测：可以利用软件将 CDS 翻译为蛋白，必要时添加碱基，使目标 CDS 与 tag CDS in frame（中间间隔的 linker 是 3 的倍数，因为编码是以 3 个碱基一组的）；如果 tag 在下游，要去掉基因上的终止密码子。
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