看Nanopore超长读长如何为高质量基因组组装添砖加瓦

听说最近大家的朋友圈被组学君家的Nanopore 两大利器——MinION和GridION刷屏了，组学君的座机（400-027-1221，广告一下组学君专机O(∩_∩)O）也被咨询Nanopore的电话打爆了，大家热情这么高，组学君也不能辜负，于是从未来组最专注的基因组组装方向，为大家整理了几篇已公布的基于Nanopore测序基因组文章，先让大家一睹为快，当然，Nanopore测序到底如何？你不来未来组试试如何知道，组学君等你。

万事开头难，先从模式物种来

线虫基因组组装及复杂区域重排检测

Whole genome sequencing and assembly of a Caenorhabditis elegans genome with complex genomic rearrangements using the MinION sequencing device

建库信息

(2D) ONT sequencing library(SQK-LSK108)，上机4 MinION flowcells（R9.0）48hrs

(1D) ONT sequencing library（SQK-RAD001），上机2 MinION flowcells（R9.3）48hrs

（Figure 1）

Figure1 MinION 测序

下机数据

共下机1.1M reads，read长度最长123,159 bp (平均长度 4,801 bp)，其中5.33Gb 1D碱基，其互补链的2D 序列有1Gb，1D 序列比对率为~93%，2D比对率90-95%，其中，3号染色体上有~3M的duplication（chrIII:10,062,096-11,973,739）（Figure 2）。

Figure2 MinION read 比对到参考基因组

组装结果

经Nanopore数据组装可到145 Contigs，Contig N50 = 1.22 Mb，覆盖了参考基因组的99%序列。研究者并用短读长数据做了比较，经Illumina平台的~8.04 G数据，组装得到38,645 Contigs，Contig N50 = ~26 kb。通过MinION 的基因组组装结果，同时还确定了重排和插入的复杂区域结构。

高质量拟南芥基因组

High contiguity Arabidopsis thaliana genome assembly with a single nanopore flow cell typical consumer computing hardware (4 Cores, 16Gb RAM)

建库信息

1 μg gDNA ，(1D) ONT sequencing library (SQK-LSK108)（~3h），a single ONT MinION flowcell (R9.4) 48hrs

下机数据

平均读长11.4K（N50 7.5 kb），3.4G base-called sequence，平均质量值Q7.3，其中200k以上reads有4条，最长有269K，超过100kb有14条reads，50k以上有2317条reads。

组装结果

文中经多种组装软件测试，其中，minimap/miniasm组装少于1hr，racon (3x)consensus  12 hrs，pilon 进行polish 24 hrs。

ONT minimap/miniasm (ONTmin) 组装得到62 Contigs，ContigN50=12.3 Mb，覆盖了100% (119 Mb) 的非重复序列（Table 1），经BioNano光学图谱数据验证了其高连续性，并经PacBio RSII数据验证其高碱基质量。

最后研究者不忘计算此次Nanopore测序组装项目成本，总共花费了4天时间，以及包括仪器折旧和测序耗材在内1000美金。

Table 1 OxfordNanopore (ONT) 和Pacific Biosciences (PB)组装比较

模式物种搞定，再来点非模式物种

Gb级别番茄基因组组装

Reconstructing the Gigabase Plant Genome of Solanum pennellii using Nanopore sequencing

建库信息

通过2种片段方式建库：

a. 富集长片段（12-80 kb，12-50 kb）建库，(1D) ONT sequencing library (SQK-LSK108)，20 μg DNA/library，29 ONT MinION flowcell (R9.4)

b. 未经片段筛选建库，24 μg DNA/2 library，2 ONT MinION flowcell (R9.4)

下机数据

共下机数据131.6G，平均一个Cell 4G产量，passed filter（Metrichor 1.121 base caller） 数据有110.96G（基本上是预估基因组1-1.1G的100X测序量），过滤后的平均Q-score为7.44，在文库优化后，平均读长在6,625-15,869bp间，最长read达153,099bp。

组装结果

提取40%，60%，80%数据量，经miniasm,Canu和 SMART de novo 进行组装测试，并经二代数据polish，其中Canu-SMARTdenovo效果最优：Contig N50 达2.5 Mb（Figure 3）。

Figure3 不同组装策略对比

欧洲鳗基因组快速组装

Rapid de novo assembly of the European eel genome from nanopore sequencing reads

建库信息

在血液和肝脏组织中提取High MW DNA，片段化到20 kb，构建不同文库：

ONT sequencing library （2D：SQK- MAP006），于ONT MinION flowcell（R7.3）上机；

ONT sequencing library （2D：SQK-NSK007和1D：SQK-RAD001），上机MinION flowcells（R9.0）；

ONT sequencing library （SQK-LSK108和SQK-RAD002），ONT MinION flowcell（R9.4）。

下机数据

下机数据共15.6G（Table 2），k-mer分析预估基因组~860 Mb，下机数据基本上是基因组18X测序深度。

Table 2 Nanopore测序

组装结果

研究者开发组装新工具TULIP（The Uncorrected Long-read Integration Process），在二代数据基础上组装得到基因组891.7 Mb，Contig N50为1.2M，相对已有短读长组装的基因组草图提升显著。