Nature-medicine教你用GWAS RNA-Seq研究精神分裂症分子机制

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全基因组关联分析（GWAS）找到了众多单核苷酸多态性位点（SNP）于精神类疾病显著相关，但是人们对其中的内部分子机制仍然知之甚少。本文旨在研究与精神分裂症有关的遗传关联位点的生物学功能，作者首先选定一个精神分裂症易感区域10q24.32，利用转录组测序（RNA-Seq）发现一个SNP能影响BORCS7和一个研究甚少的AS3MT转录本的表达，因此称该位点为表达数量性状位点（eQTL）。为了进一步研究该SNP如何影响基因或转录本的表达，作者设计了一个荧光报告基因实验，证明与该SNP存在连锁不平衡的可变重复（VNTR）影响AS3MT启动子活性。为了更好的阐述它们的生物学机制，作者还研究了基因上甲基化水平与VNTR和转录本表达之间的关系。最后，研究人员又证明AS3MT转录本和蛋白与疾病进程存在联系。综上所述，本文通过SNP与DNA甲基化、基因表达之间的关系，建立了一个全面的精神分裂症的分子调控网络。

1. 脑组织RNA-Seq证明GWAS位点同样是表达性状位点

作者研究的第一步是对655个无精神类疾病的脑组织进行转录本测序（RNA-Seq），结合基因型数据，他们在10q24.32基因组区域内发现一个精神分裂症易感位点（rs7085104）与AS3MT和BORCS7的表达显著相关（图1.1）。随后，研究人员在精神分裂症，双向障碍，抑郁症患者的脑区中都观察到了SNP与以上两个基因的表达相关（图1.2）。

图1.1 655个无精神病样本中对精神分裂症遗传易感位点rs7085104的10q24.32区域eQTL分析结果

                                           

图1.2 不同精神类疾病患者中AS3MT和BORCS7表达与rs7085104基因型的关系

2.一个可变串联重复（VNTR）影响AS3MT启动子活性

作者很巧妙地在RNA-Seq中找到一个位于AS3MT一号外显子5’-UTR上的可变数目串联重复（VNTR），该串联重复与rs7085104有很强的连锁不平衡关系（r2=0.94）,也就意味着其同样会潜在的影响AS3MT和BORCS7的表达。随后，作者通过conditionalanalysis排除了VNTR对BORCS7表达的直接影响，进而将下一步的研究重点锁定在AS3MT上。紧接着，他们在体外构建荧光素酶报告基因系统，发现VNTR而不是rs7085104影响AS3MT启动子活性（图2）。这是一个很有意思的现象，GWAS研究仅仅能找到rs7085104与表型和基因表达存在统计上的关联，但通过分子生物学技术找到了真正起作用的信号来自于该SNP有强连锁不平衡的VNTR上。

图2. GWAS显著位点rs7085104以及与其有强LD的串联重复（VNTR）对AS3MT启动子活性的影响

3.RNA-Seq发现AS3MT存在可变剪切，并找到新的转录本

如果仅仅用转录组数据度量基因表达就太可惜了。首先，作者发现AS3MT外显子1和4之间存在大量junction reads，这意味着可变剪切的存在，因为通常情况下不相邻外显子之间不会有junction reads。随后，作者利用end-to-end PCR验证了AS3MT具有两个主要的转录本，一个是具有11外显子的全长转录本：AS3MTfull，另一个是缺少外显子2和3的转录本：AS3MTd2d3。如图3

图3 AS3MT转录本结构

4.AS3MTd2d3转录本的功能研究

请大家注意，作者接下来的工作相当精彩。

研究人员发现AS3MTd2d转录本在脑组织中的表达显著高于其他组织，尤其是海马体中（图4.1）。eQTL分析检测到rs7085104以及VNTR与该转录本的表达同样显著相关（图4.2）。通常情况下，基因表达改变也受到DNA甲基化的调控，作者在10q24.32区域内研究了844个CpG的甲基化水平。他们发现VNTR与其中一个位于AS3MT基因3号外显子上的CpG位点的甲基化水平存在关联（图4.3），该甲基化位点正好与AS3MTd2d3转录本的表达呈负相关（图4.4）。这样，作者就建立了VNTR与甲基化以及转录本表达三者之间的调控关系。

故事到此已经很明确了，AS3MTd2d3的表达受到遗传和表观遗传的双重调控，那么它的生理学作用到底是什么呢？首先，作者证明该转录本的表达在精神分裂症患者和健康人之间具有显著差异（图4.5），精神分裂症患者中表达量更高；其次，由于精神分裂症是一个神经发育类疾病，作者利用干细胞分化模型发现AS3MTd2d3的表达在诱导多能干细胞中上调。

图4.1. AS3MT转录本在各个组织中的表达情况

图 4.2 rs7085104基因型与AS3MT_d2d转录本（左）以及AS3MT_full转录本（右）关联分析结果

图4.3 VNTR基因型与甲基化位点cg08772003关联分析结果

图4.4 cg08772003甲基化水平与AS3MT_d2d转录本表达呈负相关

图4.5 AS3MT_d2d转录本表达水平在精神分裂症和健康人之间存在显著差异

写在后面

作者以一个GWAS显著位点作为切入点，利用RNA-Seq找到该位点影响表达的基因。荧光素酶报告基因系统证明影响基因表达的信号来自于一个与GWAS位点具有强连锁不平衡的可变串联重复。RNA-Seq数据发现了受遗传调控的基因上存在可变剪切的转录本，该转录本的表达受到遗传和表观遗传（DNA甲基化）的共同调控，且与疾病状态显著关联。建立了一个详尽的由GWAS显著位点到表型的分子调控网络。

参考文献：

Ming L, Jaffe A E, Straub R E, et al. A human-specific AS3MT isoform and BORCS7 are molecular risk factors in the 10q24.32 schizophrenia-associated locus[J]. Nature Medicine, 2016, 22(6):649.

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