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相信大家在做研究的时候常常遇到的问题就是基因沉默不掉，特别是通过RNAi技术把mRNA降解后，RNA水平下来了，可蛋白就是下不来，有没有？ 关于这个问题的解决我们给大家推荐一个策略，这个策略就是Cell在11月16号发表的一篇文章中所介绍的方法： 其实原理很简单：通过TRIM-Away系统对目的蛋白进行泛素化-蛋白酶体降解， 这里的TRIM-21是一个在多个物种里面高度保守的E3泛素连接酶，在这个系统里面结合目的蛋白的特异性抗体，就可以给目的蛋白加上泛素这个小分子，从而把目的蛋白送到蛋白酶体进行降解。就像我们处理垃圾一样，先把把垃圾放到黑色塑料袋里面进行标记区分，然后蛋白酶体这个垃圾处理厂就能把蛋白进行销毁处理了。 所以，这个方法有三步： （1）要有足够的TRIM-21酶。可以是细胞本身表达的（内源的），也可以把细胞进行修饰（比如先把TRIM-21进行过表达），还可以直接把TRIM-21这个纯化好的蛋白通过电穿孔的方式直接导入细胞。 （2）特异性识别靶蛋白的抗体。一般的抗体可以识别细胞质内的靶蛋白，而细胞核以及染色质内的靶蛋白则可以用纳米抗体这种比较小，从而入核容易的纳米抗体（nanobody）。 （3）TRIM-21联合抗体对靶蛋白通过蛋白酶体进行降解，这是细胞内自发的过程。 下面说一下这个方法的优势。 1. 蛋白降解的速度很快，半数降解时间只有几十分钟。 在NIH 3T3细胞中GFP的半数降解时间只有16.74min。 2. 各个细胞位置的蛋白都可以，不管蛋白是位于胞质还是核内。 分别是游离的GFP，膜绑定的GFP以及定位于染色质的组蛋白H2B。 3. 特异性好。
并通过不同的抗体分别检测TRIM-Away系统对Eg5降解的影响：
4. 可降解长寿命的蛋白。 我们补充说明一下，蛋白的表达水平是由其产生和降解的平衡所决定的，因此当我们用RNAi沉默基因表达的时候，mRNA水平的降低要通过翻译减少反映到蛋白水平的降低需要有一定时间间隔，理论上说，蛋白产生的速度如果还是高于蛋白降解的速度，蛋白水平就是下降而是升高，因此由RNAi介导的mRNA产生减少所导致的蛋白降低是间接的结果，而TRIM-Away方法则是直接介导目的蛋白的降解。而且，细胞本身也有补偿效应，我们看到的表型未必是蛋白降解所导致的，这一点上大家可以参考基因敲除实验，但我们把一段DNA序列敲除以后，实际上产生的是DNA敲除、下游RNA和蛋白变化的整体结果，因此产生的表型未必是蛋白的功能。 另外，长寿命蛋白的存活周期很长，有的甚至可达几个月甚至几十年，这些蛋白对于分裂不够活跃的原代细胞以及细胞的生存是非常重要的，因此其表达并非特别活跃，因此要研究这些蛋白的功能就很难。 比如在卵母细胞中维持姐妹染色单体结合复合物中的Rec8，在TRIM-Away系统对Rec8进行降解后，姐妹染色单体在8分钟的时候就出现了分离：
5. 适用于各个细胞系，且可以用来研究信号通路的激活或抑制。 研究分别选取了mTOR、NF-kB和巨噬细胞中焦亡通路中NLRP3进行研究， 并用雷帕霉素（Rapamycin）等作为对照，选取了293T、3T3、U2OS、RPE1、HCT116、Hela等10个不同的细胞类型，结果发现TRIM-Away系统不仅可以用来做loss of function的功能研究，还可以通过调节发挥不同功能的蛋白调节信号通路的激活或抑制。
好，文章就介绍到这里了，现在我们在DNA水平有了CRISPR，在RNA水平有了RNAi，在蛋白水平我们有了TRIM-Away，我们在科研的时候就可以把这个方法用起来了，说不定以后我们在研究编码基因功能发文章的时候审稿人就让我们用TRIM-Away系统进行验证了哦！ ref：A Method for the Acute and Rapid Degradation of Endogenous Proteins.Cell. 2017 Nov 13. pii: S0092-8674(17)31255-2. |
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