Nature communication

lab_hq 2017-12-04

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使用MST在天然的生物溶液中测定分子间相互作用

摘要

在人体内的蛋白互作反应与在体外的情况是不同的。在研究蛋白功能和开发新药的时候这一点是很重要的。在这篇文章中，我们介绍了一种高效，不限缓冲液的方法，即微量热泳动方法，这种方法可以分析蛋白分子或者小分子在生物液中的相互作用，比如血清或者细胞裂解液。这种技术以分子的热泳动为基础，提供了分子大小，电话和水化层方面的信息。我们用免疫学相关系统，包括人体干扰素 γ，以及钙调蛋白和钙离子的相互作用验证了这种方法。小分子抑制剂橡黄素和它的激酶PKA的亲和力分别在缓冲液和血清中进行测定，结果发现二者的亲和力在血清中下降了400倍左右。生物体液对亲和力的影响给予蛋白功能研究更可靠的结论，有可能促进更多高效的药物开发。

结果

实验方法 实验设置是由红外激光通过红外分色镜被耦合至荧光激发/发射通道中而最终完成成像（Fig. 1a）。激光通过物镜（此物镜也被用作进行荧光检测）聚集在样品上。这样就能够在各种微流样品隔室里，比如毛细管或者微流通道里进行热泳动观察。使用100um直径的玻璃毛细管，以及500nl的体积使得消耗的样品量很低，而且有很高的重复性。红外激光在25um的长度范围内产生一个空间上的温度分布。温度与激光功率呈线性增长。在150ms后，激光加热与散热达到平衡，得到一个差不多2-6K的稳态的温度增加。温度上升引导了一个空间上的浓度分布，这个是可以根据与荧光染料共价结合的互作分子的荧光变化观察到的。一般来说，每个蛋白分子的一个伯胺会被标记，所以染料的位置也是呈统计学的分布。考虑到一个典型的蛋白分子里的赖氨酸数量，我们可以认为标记会影响结合的机率是很低的。大部分蛋白分子被标记在远离结合位点的位置上，影响结合反应的只是小部分。为了测量蛋白分子的热泳动过程，我们对初始状态与稳态之间的浓度变化进行测量。所以可以得到样品的两个图像：在激光加热前的初始状态的图像，显示的是分子的同质均匀分布；第二个图像是激光加热数秒后的图像（Fig. 1b）。这么短的测量时间是足够的，因为在温度分布的小空间内的质量扩散是很快的。即使在测量时间内分子扩散很慢，并且没有达到稳态，浓度分布曲线在数秒后也是可以被辨识的。关闭红外激光加热，导致由于扩散运动引起的初始同质均匀浓度曲线的回复，从而提供了分子扩散系数的信息。

Figure 1/MST设置和原理.（a）实验方法. 使用一个额外的二向色镜插入到荧光显微镜中，加热的红外激光聚集到内径有100um的石英玻璃毛细管中。荧光样品通过CCD成像。（b）荧光图像. 图像通过时间形成。起初，荧光标记分子呈均匀分布。在打开红外激光加热后，分子在温度梯度场中经历热泳动力，一般会从热区向外扩散。在稳定状态下，分子会通过质量扩撒达到平衡，建立一个稳态浓度分布曲线。色码表明样品中的相对荧光。（c）稳态曲线. 人体干扰素γ在不同浓度的结合抗体（黑体x：0.1 nM，红体+：80 nM，蓝体#：500 nM）条件下的稳态分布曲线。分子损耗直接反映了结合复合体部分。

为了研究结合反应，测量实验在不同的结合配体浓度下进行。一般来说，带有荧光标记的结合分子保持固定浓度不变，未被标记的分子被梯度稀释，直到所有结合位点都达到饱和。Figure 1c显示了在不同的特定抗体浓度下，人体干扰素γ（hIFN-γ）的稳态分布曲线。在抗体低浓度条件下，曲线反映了未结合蛋白分子的热泳动；在抗体高浓度条件下，曲线反映了复合物的热泳动。对中间浓度来说，测到的分子损耗是结合和未结合状态的线性叠加：

在方程式（1）中ΔC_measured是测量到的损耗，ΔC_bound和ΔC_unbound分别代表结合和未结合状态的损耗，ƒ是分子在结合状态下的部分。在核心区域的浓度变化可以与梯度稀释的配体分子一起直接转换成结合曲线。从这些数据中可以确定平衡解离常数K_d和可能的协同效应。

蛋白分子的相互作用. 蛋白分子之间的特殊互作反应在细胞功能里有一个基本原则，而且对生物技术应用和免疫抗体实验来说十分重要。接下来我们在几个代表性的实验中应用MST，来显示它在药物开发或者研究领域，在互作反应研究方面使用的可行性。

首先，我们确定抗原 hIFN-γ（17KDa）和它的抗体（120KDa）的亲和力。hIFN-γ是一个二聚化的可溶的细胞激素，它对细胞内致病菌的免疫和肿瘤控制很重要。hIFN-γ用AlexaFluor647标记，保持固定浓度5nM，在5℃下使用PBS缓冲液。抗体梯度稀释（从0.1nM到700nM）。在结合抗体过程中，hIFN-γ的热泳浓度信号从未结合的2.14%到结合后的4.24%，得到了由于结合反应形成的2.1%的损耗差别。与未结合状态相比，损耗的水平与抗体浓度一起作图见Figure 2a。正如前面部分所讨论的一样，损耗可以被看作一条结合曲线，即形成复合体的hIFN-γ部分与它的抗体一起绘制成右轴所示的曲线图。通过方程式（4）拟合数据得到了解离常数 K_d = 10±2 nM。为了显示MST的高分辨率特性，我们绘制了预期的结合行为，解离常数为1和30 nM。

Figure 2. 使用MST测定蛋白与蛋白之间的相互作用。为了确定结合反应的亲和力，对一个结合配体进行梯度稀释，另一个结合配体进行荧光标记并保持固定浓度。（a）使用MST分析荧光标记的hIFN-γ和特异性抗体的结合力（黑色圆圈）。抗体进行梯度稀释（从100pM到700nM）。热泳信号的变化推导出解离常数 K_d = 10±2 nM。为了进行比较，虚线表示解离常数为1和30 nM。（b）自发荧光蛋白GFP与不同亲和力的配体之间的结合实验。GBP显示了很高的亲和力 K_d = 2.3±2.1 nM（黑色圆圈），此数据是根据QCM实验得到的。为了证明得到的数据真实反映了特异性结合行为，我们进行了GBP突变体（R37A）和阴性对照体RBP进行MST实验。突变体由于在结合位点处的精氨酸的变化，从而降低了亲和力，解离常数为K_d = 80±38 nM（绿色方块），RBP显示出预期的基线（红色三角）。误差靶代表三次MST测量后的每个数据点计算得到的标准偏差。

我们进一步分析了近期发表的关于GFP与小抗体片段，即GFP结合蛋白（GBP，来源于美洲驼的单域抗体）的结合反应实验（Fig.2b）。曾经的报道指出GBP在肺细胞里和免疫析出实验里都能高效结合在它的抗原（GFP）上。因为GFP有自发荧光，无需标记就可以监测结合行为。我们准备了一系列梯度稀释的GBP样品，与固定浓度为40nM的GFP相互作用，测得解离常数为K_d = 2.3±2 .1 nM，比GFP的浓度低了25倍左右。尽管如此，准确值是根据计算配体损耗可以得到的。

我们把MST得到的数据与QCM得到的亲和力数据进行了比较。在QCM技术中，GBP被固定到QCM表面，确定GFP的结合解离速率，得到解离常数为0.63 nM。与其他分子间互作技术相比较，基于表面的的方法一般都会高估互作反应的亲和力。利用MST技术得到的亲和力数据与QCM的数据是一致的。为了确定测得的MST数据显示的是特异的结合，我们分析了GBP与突变体（突变位点是结合位点）的反应。在37号位置，一个精氨酸被丙氨酸取代，由此降低了结合力。另外， RFP结合蛋白也用来与GFP反应，表明无法结合，以此来排除非特异结合的可能性。我们发现GBP突变体的亲和力为80±38 nM，RBP蛋白显示没有结合。有趣的是，GBP的损耗为1.27%，而GBP突变体（R37A）的损耗为2.82%，造成此现象的原因是热泳动幅度不仅仅取决于复合体的大小，也取决于电荷和结构的变化。因为我们用一个结构不同，且不带电荷的丙氨酸取代了带电荷的精氨酸，所以很有可能影响了复合体，这种影响也可以在热泳动幅度里看到。

小分子结合. 在检测小分子配体结合实验方面，MST具有很高的灵敏度。我们用钙调蛋白（CaM, 16.7 kDa）与钙离子的结合反应实验做了很好的展示(Fig. 3a)。CaM在人体细胞中是主要的钙离子受体，在钙功能中扮演着中介物的作用，也调控许多细胞进程。通过它的构象状态，CaM结合或者调控许多靶标蛋白。在与钙离子的结合行为中，它经历了构象上得变化，每个 CaM重排了超过35个水分子，导致在热泳动性质上有很明显的变化。为了研究结合行为，我们把钙离子作梯度稀释（从1nM到50uM），CaM保持150 nM的固定浓度进行反应。我们推导出解离常数为2.8±0.2 uM，协同常数为1.97±0.2 uM。这个数据与文献报道的解离常数（从1到10 uM）是一致的。我们选用镁离子作为负对照实验与CaM进行反应。两种离子都带有相同的电荷，大小也类似。测试发现根据改变镁离子浓度，并没有损耗发生，因此排除了非特异性结合的可能性，钙离子与钙调蛋白的特异性也得到了证实。

Figure 3.小分子和离子的结合力分析。（a）钙离子与带荧光标记的钙调蛋白在PBS缓冲液里的分析。钙离子的浓度从1 nM变化到100 uM，钙调蛋白的浓度保持150 nM。为了检测反应的特异性，选用镁离子做相同的梯度稀释。我们测得钙离子的解离常数为K_d = 2.8±0.2 uM（黑色圆圈），镁离子并未发现结合（红色方块）。（b）不带电荷的小分子抑制剂橡黄素与蛋白激酶A（PKA）的MST分析（黑色圆圈）。橡黄素作梯度稀释（从11.5 nM到50 uM），荧光标记的激酶保持固定浓度300 nM。虽然分子量只有很小的变化，但是信噪比达到12.5个单位，所以确定了相互作用的强度。亲和力被确定为130±30 nM，与文献报道的数据吻合。误差靶代表三次独立MST测试后的各个数据点计算得到的标准偏差。

我们也可以使用MST测量不带电荷的小分子抑制剂与靶标蛋白的结合。蛋白激酶A（PKA，38kDa）与抑制剂橡黄素（0.34kDa， Fig.3b）的结合反应中，激酶被荧光标记，并保持300 nM的固定浓度。橡黄素作梯度稀释（从50uM到50mM），缓冲液为HEPES和5% DMSO。我们发现亲和力为 130±35 nM，结果与文献报道的数据（从nM到uM范围均有）一致。在实验中，PKA的热泳浓度从未结合状态的3.8%变化到了结合状态的4.53%，显示了结合到橡黄素上的19%的变化量。复合体的分子量变化只有1%，而且也没有电荷变化，所以我们认为水化层的变化是热泳损耗变化的主要原因，而水化层的变化是来源于结合口袋里的水分子的移位或者蛋白质经历构象变化时的水分子重排。

本实验证明MST是适合分析小分子的结合反应的。由于MST在分析热泳信息的高精确性能，离子结合反应在信噪比达到5个单位以上就可以检测到。在橡黄素结合实验中，我们发现信噪比达到了12.5个单位，证明即使很微小的变化也能被MST检测。

在细胞裂解液和血清里的竞争性结合实验. 现在，蛋白互作反应分析都几乎在模拟自然条件的缓冲盐溶液里面进行。尽管如此，这些溶液缺乏很多在天然生物液里所含有的成分，而这些成分对结合行为有着很显著的影响。在人工环境下的分析不能提供精确的在人体内的结合行为的信息，在开发备选药物的时候有可能导致错误的决定。

如下图所示，MST可以分析在复杂生物液中的蛋白质和小分子的相互作用，收集在接近体内环境条件下的结合信息。通过使用红色荧光标记，我们避免了由于在细胞粗提物或血清中的自发荧光引起的背景荧光影响。我们发现在细胞粗提物中，亲和力会显著降低（Fig.4a）。在hIFN-γ实验中，在细胞粗提物里的表观解离常数是165±26 nM，而在PBS缓冲液中是10±2 nM。生物分子的亲和力似乎很大程度上取决于周围的环境条件。如此显著的亲和力下降有可能是由于生物液中的某些成分的竞争性反应，或者分子粘度，pH值或离子强度等因素的变化造成的。只需要几微升的样品量，MST就可以检测细胞悬液的上清层中的未纯化的过表达的抗体，这为快速选择抗体又开辟了一条新的道路。

Figure 4.在生物液中的相互作用的MST分析。（a）hIFN-γ与抗体的相互作用分别在缓冲液中和在细胞裂解液中进行比较。亲和力在缓冲液中（黑色圆圈）是10±2 nM，在细胞裂解液中（红色方块）是165±26 nM。（b）抑制剂橡黄素与蛋白激酶A在血清里的结合行为。在5%血清里的表观解离常数从0.13±0.04 uM（黑色圆圈）变化到6±0.4 uM（绿色方块），在30%血清里的表观解离常数变化到50±7 uM（红色三角）。（c）使用MST测量橡黄素与HSA的结合（黑色圆圈）。MST数据产生解离常数为9.3±0.5 uM，协同系数2.75±0.2 。（d）使用与5%和30%相一致的HSA浓度，得到了与在真实血清里一致的结果。使用32 uM的HSA,表观亲和力为7.8±0.6 uM（绿色方块），使用190uM的HSA,亲和力为43±6 uM（红色三角）。黑色虚线代表橡黄素与PKA在缓冲液里的结合行为。误差靶代表三次独立MST测试后的各个数据点计算得到的标准偏差。

前面章节所讨论的小分子结合配体有可能成为备选药物。使用MST，小分子化合物的相互作用可以在复杂生物液中进行量化分析。我们分别在5%和30%的血清里对橡黄素进行梯度稀释，最后得到的解离常数分别为6±0.4 uM和50±7 uM（Fig.4b）。两个实验都有协同效应，其协同系数为1.5。为了理解亲和力发生巨大变化的原因，我们分析了大多数血蛋白，人血清白蛋白（HSA）对橡黄素与PKA结合的影响。由于它有一个疏水性的结合口袋，所以蛋白质是一个对大部分小分子来说是一个通用的运输蛋白，而且对于黄酮类化合物比如橡黄素来说是易于结合的。如果橡黄素吸附到血蛋白上，那么结合到PKA上的小分子的有效浓度就会降低，导致表观结合常数的巨大变化。为了验证HSA是否能引起PKA和橡黄素结合的表观亲和力的变化，我们分析了橡黄素与HAS的结合力（Fig.4c）。HAS被标记荧光，橡黄素进行梯度稀释（0.5dao 90 uM）。热泳损耗显示一个S型的结合曲线，此曲线与希尔公式能够匹配。从数据中，我们推测解离常数为 9.3±0.5 uM，希尔系数为2.75±0.2，与文献报道的数据吻合。这个实验显示了橡黄素与HSA是结合的，而且有可能影响了PKA与橡黄素在血清里的表观亲和力。

为了证明HSA是影响人体血清里的亲和力的变化的因素，我们分别检测了50 mM HEPES缓冲液里的PKA与橡黄素的结合实验，以及加入HSA 后，在5%和30%的血清里的PKA与橡黄素的结合实验（Fig.4d）。在加入32uM的HAS和5%的血清里，我们得到解离常数为7.8±0.6 uM。在加入190 uM的HSA和30%血清里，我们得到解离常数为43±6 uM。加入HAS后解离常数的变化与只在血清里测得的数据比较，相差了20%左右。所采用的实验缓冲液里，离子强度和分子粘度都是固定的，在血清里的亲和力变化很有可能是因为橡黄素与PKA结合的影响。