CAR-T细胞的改造新思路

摘要：

基于TCR信号进行设计的CAR-T细胞，在难治性的B细胞恶性肿瘤治疗中已经勘称成功。但CAR-T细胞在治疗上皮源性恶性肿瘤的的安全性和有效性上均有待提高。除了CD3ζ和CD28磷酸化引起的信号传导外，TCR信号其它方面对T细胞的分化能力和功能也非常重要。在此，我们就包括空间结构、结合/解离系数比、突触形成的TCR识别原理和CAR相关信号进行深入分析和探讨，以期进一步探索出更安全有效的肿瘤靶向受体。

来源：  上海细胞治疗工程技术研究中心|叶真龙 姚寒

前言

随着基因工程技术的发展和对T细胞识别认识的提高，肿瘤靶向受体——CAR应运而生，因此也有了将CAR转染至人的T细胞从而增强过继免疫治疗的抗原识别特异性和杀伤功能的技术。CAR的设计基础是将胞外配体识别区域——较为典型的是单链可变区域---scFv片段，与包括CD3ζ的胞内信号分子连接起来，再通过与抗原相互作用有效激活T细胞。胞内信号分子模块从第一代CAR的单个CD3ζ信号结构域到第二、三代的共刺激信号分子（TCR识别过程中APC细胞提供的共刺激分子信号对T细胞的彻底激活必不可少）CD28、4-1BB/OX40、CD3ζ的多种信号结构域[1,2]。共刺激分子的引入在体外能有效增强CAR-T细胞的细胞因子释放和细胞增殖，携有CD28或4-1BB信号分子的二代CD19 CAR-T细胞在对B细胞恶性肿瘤治疗的动物模型和临床前研究中已经展示了有力的抗肿瘤活性[3-14]。

尽管建立在TCR信号的基础上，针对CD19抗原分子的CAR在难治性B细胞恶性肿瘤的治疗中已经取得巨大成功（表1）。但同时也造成一些严重的副作用，包括细胞因子释放综合征和器官毒性[10, 12-14]。因为CAR的识别作用不受HLA限制，因此只要患者的肿瘤组织表达CAR靶向的抗原，理论上都会对CAR治疗有反应，很多实验室和相关公司也在尝试将这种新型的CAR治疗方法用于上皮源性肿瘤的治疗。为此，CAR的肿瘤特异性、敏感性、安全性以及对T细胞的引导机制和细胞命运均有待提高。

表1. CD19 CAR-T临床试验列表

近来，TCR识别的研究成果可能对CAR的设计和功能的提升具有一定的指导意义。下游T细胞功能、细胞命运都受TCR与MHC/多肽复合物亲和力的影响，而该亲和力由T细胞与APC细胞之间的空间结构、结合/解离系数、免疫突触形成、TCR成簇聚集以及MHC分子与CD4和CD8的复合受体相互作用等因素决定[15-17]。下面在现有的对TCR信号如何影响T细胞识别的认识基础上，就T细胞与靶细胞相互作用的特异性、空间结构域和受体亲和力是如何影响CAR的设计和功能的进行深入探讨。

特异性：特异绞杀肿瘤细胞的同时不能枉杀正常细胞

CAR设计的首要重要难点就是如何保证在杀伤肿瘤细胞的同时，不伤害正常组织和降低副作用。普通T细胞通过自身TCR能非常有效的区分外源多肽/MHC（pMHC）复合物和自身pMHC复合物。在成千上万的自身pMHC复合物中哪怕仅仅有个位数的pMHC激动分子也能引起相应的T细胞激活[18-20]。这种特异性部分由胸腺中单个特定的TCR谱从足够应付所有外源pMHC，且对自身pMHC具有微弱亲和力的TCR库中的挑选和富集过程赋予。除此之外，活性APC细胞提供的TCR/CD3ζ第一信号和共刺激分子受体第二信号的共同作用也是特异性不可或缺的条件。

图1.CAR-T细胞和传统T细胞与肿瘤细胞互作示意图。左为传统T细胞，右为CAR-T细胞。

虽然CAR的特异性和安全性取决于靶点的选择，但是绝大部分的靶点并不完全是肿瘤细胞特异性表达的。比如，CD19和CD20在正常的和恶性的B细胞都有表达，因此靶向这些抗原的二代CAR在杀伤恶性B细胞的同时也杀伤了正常B细胞，因而造成与功能CAR-T细胞存活期一样长时间的B细胞耗竭副作用[10, 12-14]。条件性表达自杀基因的CAR-T细胞可以避免此类副作用，因为自杀基因的激活诱导CAR-T细胞的死亡，而B细胞则重新从造血干细胞分化形成。CAR-T细胞转染并表达可诱导形式的caspase-9（iCasp9）蛋白，药物AP1903的使用能激活iCasp9蛋白形成二聚体，从而介导T细胞凋亡。iCasp9基因表达载体系统已经在临床前和Ⅰ期临床试验中展现出有效的诱导T细胞自杀效果[21]。对CAR载体改造使其表达EFGR、CD20等表面标记，再用相应的特异性抗体对CAR-T细胞进行消除[22, 23]。还有另一种方法就是将整个CAR载体置于能操控的开关系统下，用相应的小分子药物对其进行消除，比如体外已经采用过的Tet-on或四环素诱导系统，就能有效的对整个CAR系统进行开启或关闭[24]。在一些肿瘤中，存在肿瘤特异性表达的而一般正常组织不表达的表面抗原分子，如ROR1和GD2[25-27]，和由致癌突变形成的肿瘤特异性新抗原，比如EGFRvⅢ，发生2-7号外显子删除，但依然具有信号传导功能，以及其它一些CAR-T细胞靶点，比如Her2/Neu，mesothelin（上皮素）和MUC16等在肿瘤细胞中也处于高表达状态[28-30]，但靶向这些差异性表达抗原的CAR能否有效的在不伤害正常细胞的同时对肿瘤进行有效杀伤有待进一步验证。但从目前试验数据看来这类靶点会引起对正常低表达靶点抗原细胞的毒副作用，此外低表达靶点抗原的肿瘤细胞突变体亦能逃脱。

激活的APC细胞提供的共刺激第二信号能确保TCR信号在合适的环境下被抗原有效激活。有些研究小组也尝试用双CAR系统分别表达第一信号和第二信号从而来提高其肿瘤特异性，并减少对正常细胞的副作用。但这种双受体方法也被证实充满了挑战，其成功可能取决于CAR的选择和靶点抗原的选择。比如，Wilkie等人用分开的双CAR系统分别靶向高表达抗原Her2和Muc1。其中Her2特异性结合的CAR仅有CD3ζ结构域，另一个Muc1特异性CAR含有CD28结构域，分别携带T细胞激活的第一信号和第二信号。从理论上来说，这种双特异性的CAR-T细胞只能与Her2/Muc1双阳性靶细胞，而不是Her2或者Muc1单阳性的细胞识别结合后才能获得第一信号和第二信号从而有效增殖[31]。但体内外试验均显示，这种双特异性的CAR-T细胞不但能杀伤Her2 MUC1 双阳性的细胞还能杀伤Her2 Muc1-细胞，这也说明，Her2特异性的CAR提供的第一信号就足以介导其对靶细胞的杀伤作用。Grada等人采用双CAR系统分别靶向CD19和Her2也遇到类似问题，即双特异性CAR-T细胞依然能杀伤CD19 和Her2 单阳性靶细胞[32]。与单CAR系统相比，双CAR系统无法有效区分双阳性靶细胞和单阳性靶细胞这一点严重限制了双CAR系统的应用。Kloss等人称如果能将第一信号的强度稍微减弱一些，从而可能使T细胞杀伤活力也需要第二信号的参与。他们首先以CAR形式检查出前列腺癌干细胞抗原特异性（PSCA）的scFvs片段，并选出在T细胞表达后体内外均不足以杀伤PSCA 肿瘤细胞的理想的CAR。当这个CAR和表达CD28与4-1BB共刺激信号分子的PSMA特异性CAR在体内T细胞共表达时能有效识别并杀伤PSCA PSMA 双阳性的靶细胞[33]。这也是一种有效的既能提高CAR特异性，也能减少副作用的方法。

还有一种提高特异性双CAR系统，就是其中一个靶向正常细胞，而不是肿瘤细胞，并对其提供负调控信号（图2）。这种抑制TCR信号的策略采用的是T细胞活性的负调控机制。当T细胞活化后，一些TCR信号抑制性受体包括PD-1和CTLA-4的表达会上升，并通过竞争性结合共刺激分子配体（比如CTLA-4结合CD28分子配体CD80和CD86）或通过炎性因子上调APC细胞表面的相关配体（比如PD-1与PD-L1和PD-L2）对T细胞活性进行负调控。这些负调控反馈机制能防止T细胞过度活化并减少炎性反应对机体的损伤。PD-1和CTLA-4基因敲除小鼠患有自身免疫和淋巴组织增生疾病充分证实上述机制[34, 35]。另外，PD-L1免疫负调控因子在免疫豁免部位，比如眼睛的神经元，胎盘的滋养层中会持续表达，保护这些组织使其免受机体的免疫攻击[36]。这些抑制性受体在慢性炎症和肿瘤发生过程中因长时间暴露于抗原下而“枯竭”的T细胞中也普遍高表达，靶向PD-1和CTLA-4抑制信号的免疫治疗在临床中已经被证实能有效上调T细胞活性[37, 38]。

图2. 多种双CAR系统示意图

同样，该模式也可以用来对CAR的识别过程进行调控，抑制性CAR通过靶向正常细胞，而不是肿瘤细胞，可以使正常细胞和组织免受CAR-T细胞的攻击。Fedorov等人通过共表达携带有CD3ζ与CD28结构域CD19-CAR和携带有PD-1或CTLA-4结构域的PSMA-CAR证实了上述模型在CAR-T中的可行性[39]。该方法制备的CAR-T细胞能有靶向CD19 PMSA-的靶细胞，但CAR-T细胞的增殖活性、靶细胞的裂解活性和炎性因子的释放活性均受PSMA 靶细胞的抑制。该方法特别适用于靶向肿瘤相关抗原的CAR的特异性的提高。尽管如此，用于传递负调控信号的正常细胞特异性抗原的选择是一大技术难点，另一大挑战就是，在设计抑制性的CAR时，这些抑制受体对TCR信号的抑制作用机制尚不清楚。比如，PD-1通过与TCR簇在突触中共定位，通过招募SHP2蛋白并使附近的TCR信号分子，包括CD3ζ、Zap70和PKCθ去磷酸化来抑制TCR信号[40]。因此，PD-1介导的抑制性CAR与活化的CAR的共定位对其抑制功能的发挥至关重要。不同的是，CTLA-4是通过与共刺激分子CD28竞争性结合CD80/CD86分子，从而将CD28分子排挤在突触中之外，进而抑制共刺激信号[41]。近期研究显示CAR中的CTLA-4分子表达后的首要任务竟是调控细胞表面CTLA-4的表达而不是诱导下游的抑制信号通路[42]。这也说明，这种抑制性CAR的功能可能竞争不过携带有共刺激信号的二代或三代CAR。另外，研究还表明，与二代CAR相互作用时，PD-1介导的抑制性功能比CTLA-4介导的更有效[39]。

最后我们希望弄清的是，双CAR系统与传统的TCR信号的不同之处，那些不同之处可以用来开发更有效的CAR。一些研究采用还原式的方法，用平面脂双层充当APC细胞来研究突触形成过程中蛋白之间相互作用的空间变化[43]。该方法对CAR与配体之间的有效分子比的计算具有重要的指导意义，甚至还有可能用于评估不同表达水平的抗原能否成为CAR系统的理想靶标。另外，有研究报道称，共刺激或抑制性CAR与TCR在突触处的共定位对于其发挥相应的共刺激或抑制性功能至关重要[40, 41]。因此，活细胞成像技术在研究CAR信号中的空间变化和双CAR系统与传统T细胞信号有何不同之处时就非常有用。

T细胞与靶细胞相互作用的结构限制

TCR识别的结构和空间要素精确的调控着T细胞和靶细胞间的相互作用，可人工CAR相关的调控性结构和空间要素就难以阐明。在免疫突触形成过程中，由于TCR和pMHC复合物的结构缘故，T细胞和APC细胞之间的距离约15nm。磷酸化酶CD45和CD148由于具有远长于15nm的外功能区而被排挤在突触外，从而使无负调控因子情况下的TCR诱导的酪氨酸磷酸化过程顺利进行。研究表明具有更短的外功能区的突变型CD45蛋白削弱了T细胞相关信号，这也验证了上述的分子排挤作用在T细胞信号中的重要性[44, 45]。

CAR与靶点抗原之间的空间距离对于相应的T细胞信号可能也同样重要，只是这一空间距离取决完全不同的结构因素，包括与靶点抗原表位的位置以及scFv和T细胞膜之间的连接区域。有研究显示，靶点抗原表位与T细胞膜之间的距离越短越能有效激活CAR-T细胞[46-50]。比如，Hombach等人报道称，识别CEA抗原上离细胞膜较远的“N”端表位的CAR-T细胞仅仅被微弱的激活，而当他们对CEA抗原进行改造，拉近该“N”端表位与细胞膜之间的距离后，CAR-T细胞更有活力[46]。这说明，靶向细胞膜远端表位可能形成较大的空间，从而允许大型磷酸化酶CD45和CD148的进入，因此抑制了CAR信号的激活。缩短scFv片段与T细胞膜之间的空间距离，促进突触的形成，对由于靶点抗原表位位置引起的空间限制也具有一定的缓解作用。作者的体外研究也发现，当缩短scFv的长度，靶向酪氨酸激酶ROR1的远端表位的CAR能更有效的识别ROR1 肿瘤细胞并诱导T细胞的功能[51]。胞外片段长度的缩减有可能使得T细胞和靶细胞之间距离缩短，从而有效的将大型抑制性分子排挤在突触外。但相反的是，当我们靶向酪氨酸激酶ROR1的近端表位时，较长的胞外片段反而对T细胞功能有利，这说明，CAR的最佳胞外片段的最佳长度因受靶点抗原表位位置的影响[52]。因此，在设计CAR时，应该根据靶点抗原表位的位置来优化胞外片段的长度。活体成像技术可以为CAR-T细胞与靶细胞之间的空间结构研究提供更精确的信息。

采用逆转录病毒或慢病毒基因转染技术，可以使原始T细胞表达GFP荧光蛋白，从而能体内捕获T细胞和APC细胞的相互作用[53, 54]。该技术可以用来进一步确认改变CAR胞外片段的长度是否对突触的形成和/或排挤CD45或CD148的过程有影响[55]。有趣的是，近期一项研究报道称，将表达CD19-CAR的HEK细胞和CD19 的Raji细胞共培养时，发现受体在APC细胞和T细胞相互作用的交界处发生聚集，并能招募Zap70蛋白，排挤CD45蛋白。值得注意的是，这项研究用的是HEK细胞而不是T细胞。但研究结果表明，至少在一定的环境下，CD45还是会被排挤在CAR-T细胞和靶细胞形成的突触之外。研究中的CD19-CAR-HEK细胞的交界处非典型的高度卷曲，而TCR-pMHC交界处更为平滑有序，这也说明，不同类的CAR表达细胞形成的突触有所不同。因此，体内外对原始CAR-T细胞和靶细胞之间的全面分析，对其与传统T细胞之间在突触形成过程、组合过程和排列过程等方面的不同显得尤为重要。

亲和力和敏感性

肿瘤细胞表面抗原一般都处于低水平表达，这也是CAR-T细胞杀伤效果提高的一大障碍。在CAR-T临床治疗效果较好的CLL和ALL肿瘤细胞中，每个肿瘤细胞表达的CD19分子约在1000个左右，是其它抗原分子的2-5倍之多，比如ROR1分子。有效激活T细胞的抗原表达密度受抗原类型以及CAR制备过程中的CAR表达量、scFv片段亲和力、空间构造和肿瘤细胞的粘附、共刺激分子配体的表达等因素的影响。近期一项研究报道称，对于CD20-CAR来说，靶细胞表达CD20分子密度在每个细胞200个左右就足够诱导CAR-T细胞对靶细胞的裂解作用，但需要约10倍的密度来诱导细胞因子的产生。结果，CD20-CAR-T在体外甚至能杀伤CD20低表达的淋巴瘤细胞和血癌细胞[56]。这方面的研究对确定诱导CAR活性的抗原表达密度和预测肿瘤细胞或正常细胞是否能引起CAR的活性非常有用。

传统TCR的研究对靶向低密度表达抗原的CAR的设计具有重要的指导作用，传统TCR对低密度抗原也是极其灵敏。成像技术研究表明，低至一个pMHC分子也能诱导初始 T细胞释放细胞因子[18]。TCR的敏感性和特异性机制目前尚不完全清楚，因此也是重要的研究领域。TCR高灵敏度一方面是通过激活共刺激分子受体，从而降低TCR激活的临界值实现的。在无CD28参与的情况下，T细胞需要非常高数量的TCR-pMHC相互作用和持续刺激，然而CD28共刺激分子使得T细胞对更低数量的TCR-pMHC相互作用发生反应[57, 58]。同样，其它受体，比如NKG2D，在TCR激活的过程中，通过增强IL-2的分泌和T细胞的增殖发挥共刺激分子受体的功能[59]。因此，这类共刺激分子受体也可以考虑用于提高CAR系统中T细胞对靶向抗原的灵敏度。

TCR高灵敏度的另一种解释是“连环诱导”理论，即多个TCR共同传送pMHC分子给T细胞激活，在此过程中，TCR与pMHC分子的低亲和力和快速解离也很重要[60]。与之不同的是，表面等离子共振技术揭示CAR的亲和力一般比TCR/pMHC高，其功能随着scFv片段亲和力的增加而增加。比如，Hudecek等人检测了一组靶向ROR1的CAR，发现scFv片段的亲和力越高，CAR对ROR1 套细胞淋巴瘤和上皮细胞系的体内外杀伤效果越好[51]。尽管如此，也有报道称CAR和TCRs都存在亲和力临界值，高于临界值其T细胞功能不增反降[61-63]。在一项靶向pMHC的CAR研究中，研究者发现，与αβTCR一样低的多肽浓度，CAR的亲和力、表面表达越高反而降低其灵敏度和裂解活性[63]。这些研究说明：CAR的功能具有最佳的亲和力范围。

精确检测结合/解离系数的工具的开发对CAR的合理设计也很重要，能以活细胞表达CAR的形式对其靶标进行筛选从而优化CAR的亲和力和敏感性更好，尤其是那些低密度的靶点抗原。近来，Busch和同事开发了这样一种技术，采用实时显微技术分析研究活性T细胞TCRs的解离系数[64]。在该方法中，单体pMHC分子被荧光染料标记，有的pMHC分子通过Streptag序列在Streptactic骨架上多聚化，并与有活性的特异性T细胞结合对其进行荧光标记。但D-biotin的加入，因其对Streptag序列比pMHC具有更高的亲和力，会取代在Streptactin上的pMHC，仅留下单体pMHC分子与TCRs结合。再用荧光显微镜检测荧光强度的衰减定量计算pMHC与TCR的解离速率。同样的技术也可以用于体内外计算CAR-T细胞与高或低密度表达的靶点抗原的解离系数。

另一种方法就是直接用CAR和scFv片段库进行扫描做成CAR后用慢病毒转染至T细胞中表达，再检测其对目的肿瘤细胞的杀伤作用[65]。现有的扫描scFv片段的方法都涉及表面抗原表达的检测。尽管在这种条件下scFv片段能识别相应的抗原，但在T细胞表面以CAR形式表达出来就不一定同样这么有效，因为在T细胞表明的粘附分子和其它分子都会影响T细胞与肿瘤细胞间的相互作用。以scFv片段库形式的CAR在T细胞中表达后与相应的抗原相互作用，从而筛选出最有活力的T细胞，这种方法直接筛选对T细胞诱导激活和增殖最理想的scFv片段，而不是根据最高亲和力等参数进行筛选。因为，现在的数据表明最佳的CAR亲和力也一定适用目的靶点抗原，上述通过检测T细胞中CAR的表达的方法对特定scFv片段和靶标相互之间最佳亲和力范围的鉴定尤为重要。

缺失的信号传导板块

另一个在TCR识别信号的放大机制在CAR中没有的就是CD4-CD8复合受体与pMHC复合物之间的相互作用。CD4-CD8的复合受体因能招募Lck分子而在TCR信号起始过程中扮演中重要的角色，Lck分子能与附近的TCR/CD3ζ复合物的胞内尾部结合，并磷酸化CD3ζ链的ITAM，从而促进Zap70分子的结合和磷酸化并提高它的裂解活性。尽管如此，一旦Lck分子被激活，CD4-CD8复合受体也能微弱的与自身pMHC复合物结合并激活相应的TCRs[66]。较为乐观的是，TCR仅仅是微弱的自身反应，因为上述那些作用对外源pMHC/TCR相互作用信号放大也很重要[67, 68]。尽管目前已经证实CAR能有效磷酸化Zap70蛋白并启动下游的TCR信号[69]，但该过程中CAR是否与CD4-CD8复合受体或者TCR/CD3ζ胞内区域相互作用尚未知晓。有研究报道，CAR中含有CD3的跨膜区能使CAR与CD3ζ胞内区域相互作用增强[70]，并参与形成TCR簇，因为CD3ζ链已经被证实能通过其跨膜区域与αβTCR相互作用[71, 72]。尽管如此，该研究采用的是Jurkat细胞，Jurkat细胞与原始T细胞相比，TCR信号蛋白表达可能存在不同。另外，还有研究也发现，相比CD28跨膜区，CD3跨膜区的使用会降低CAR的表达量和蛋白的稳定性[7]。因此，CAR是否也像TCR一样形成突触并聚集成簇或者与TCR/CD3复合物和复合受体相互作用依然未知。CAR设计过程中能增强其与复合受体相互作用的策略可能使单个CAR的激活可以被TCR的连续刺激增强。

其它的胞外结合结构域

抗原受体的设计目前使用最为广泛的胞外结合部分就是scFv片段。因此，新CAR的开发严重依赖于scFv片段的构建， scFv片段的制备都是从现有的杂交瘤中选取靶向肿瘤相关抗原的鼠源单抗VH和VL片段，再连接而成。除了可选择的单克隆抗体具有一定的局限性外，scFv片段与TCR之间也存在至少以下两方面限制其应用的不同之处：1）scFv片段对抗原的亲和力比TCR要高出许多，这会影响相关的信号传递；2）scFv片段的特异性仅局限于肿瘤细胞表面抗原，对肿瘤细胞胞内抗原没有作用。因此，开发与TCR更为相似的CAR识别区域对CAR-T细胞功能的提升是一个非常重要的方向。有些研究小组正在尝试用噬菌体展示和杂交瘤技术来分离“TCR类似”抗体，这些抗体与肿瘤来源的多肽以HLA限制性方式结合，并且对MHC分子表面的胞内肿瘤抗原具有与TCR相似的特异性。但其高亲和力的抗体特性并没有改变，而TCR截然不同[63, 73]。

对于从非scFv类型的能模拟TCR识别结合的蛋白中挖掘并设计受体识别结构域的努力从未停止过。有平台采用由正常锚蛋白改造而来的锚蛋白重复蛋白（DARPins），因为锚蛋白本身的作用就是调控高亲和力蛋白之间相互作用的，因此，该重复蛋白也可以用于对亲和力、结合和解离速率以及复合物间的特异性的精密调控[74]。DARPins是从结合Her2和EFGR的噬菌体或核糖体展示库中筛选出的，目前我们课题组正在检测含有DARPins结合区域的CAR的功能。程序计算方法也被证实对各种类型靶点的受体蛋白的设计有很大帮助，而且还具有一些独特优势[75-77]。该方法可能在更像TCR的CAR的设计中有重要的应用价值，这种CAR不但是根据对某特定抗原的特异性，还包括结合/解离系数、与靶点表位的结合距离、与TCR/CD3和/或复合受体的胞内区域作用能力等因素综合筛选出的。

在选择这些方法时，还有一点需要考虑的就是，多肽结合区域和/或CAR载体元件表达序列的融合位点新型序列的免疫原性增强带来的潜在影响。CAR上scFv片段的免疫原性由于是从人的scFv库中选的而不会造成太大的影响。另外，在生物信息学工具的协助下，融合部位可以稍微改造下，使其对MHC与多肽序列的结合有所限制，尽管抗体对这些序列的识别具有一定的限制作用。在临床应用，这些蛋白的人源化以及免疫原性的限制对其疗效至关重要。

总结

尽管CAR-T细胞治疗对白血病和淋巴瘤已经取得巨大的成功，但由于缺乏肿瘤特异性抗原靶点以及免疫抑制性微环境的影响，CAR-T对上皮源性的恶性肿瘤的治疗依然充满挑战（表2）。

表2. CAR-T细胞系统存在的疑问和相应的策略

新技术对CAR信号的深度分析对CAR与TCR之间是如何不同，并如何进一步提高其临床应用是非常必要的。接下来对CAR信号与TCR信号是如何不同，有那些TCR信号元件可以用于CAR的设计都需要采用更高级，更全面的方法进行。质谱分析技术能够使TCR和CAR信号引起的相关胞内磷酸化过程进行定量分析。该技术目前已经被不少的团队用于对Jurkat细胞和小鼠转基因T细胞内TCR信号传导中磷酸化的作用的系统化分析[78, 79]。对CART细胞和传统的T细胞之间的磷酸化酶组进行客观分析，包括激活前后，对鉴定出两种细胞必需的信号通路以及其差异性有巨大帮助。质谱技术还甚至可以用来对其它包括泛素化、甲基化等翻译后修饰进行定量分析，这也为CAR或TCR激活后引起的蛋白修饰提供蓝图。同样，基因组转录分析也能为CAR-T细胞信号传导以及激活后的效应功能和细胞命运研究提供另一种全新的视野。单细胞RNA测序包含更有力的信息，并能在细胞水平揭示出肿瘤异质性屏蔽的基因转录差异性。 

CAR信号是如何影响CAR-T细胞分化形成长寿命的记忆细胞的，这一点目前仍未全知，但这对恶性肿瘤细胞的彻底消除至关重要。表观遗传修饰，包括对DNA和/或组蛋白修饰都已证实在CD4 辅助T细胞分化和CD8 记忆细胞的形成过程中具有重要的作用[80, 81]。采用ChIP-seq技术，多种类型细胞转录水平的“通过型”和“阻断型”组蛋白修饰都可以被定量化并详细绘制。比如，O’Shea小组就采用这种技术对初始T细胞分化形成Th1, Th2和Th17辅助T细胞过程中的表观遗传修饰进行研究，并探索出这些细胞的可塑性[82]。NGS下一代测序技术同样也可以用来对DNA甲基化位点进行基因组水平的探索，其中DNA甲基化在造血干细胞的分化过程中具有重要的作用[83]。更全面对CAR-T细胞的表观遗传学分析为CAR信号影响CAR-T细胞的细胞因子释放、分化和记忆细胞形成机制提供更深入的了解。

CAR-T细胞对许多难治性癌症的疗效和应用价值已经获得公认，但对CAR-T细胞的应用价值的挖掘还充满挑战。开发出更安全，更有效的CAR，需要打破传统的思维方式，从受体设计、细胞改造、与TCR进行对比、所有T细胞生物学知识和肿瘤微环境改造等方面进行探索。目前可知的是，CAR-T细胞与肿瘤细胞间的结合亲和力，结合/解离系数和空间构造都是影响CAR信号激活T细胞识别肿瘤的因素。对这些参数的研究数据能为CAR-T细胞在实体瘤中的应用提供新的角度。如何通过基因修饰技术克服肿瘤免疫抑制以及CAR-T细胞与其它包括检验点抑制剂都是CAR-T细胞的发展趋势。

来源：Engineering CAR-T Cells: Design Concepts