体外模拟消化法优化生长猪饲粮非淀粉多糖酶谱

导读

非淀粉多糖(NSP)作为一种抗营养因子，常影响畜禽饲粮营养物质的消化。NSP 酶由于可降低NSP 的抗营养作用，越来越受到关注。许多研究表明，NSP 酶能够降低NSP 的抗营养作用，提高营养物质利用率，改善肠道健康。但是也有研究发现，NSP 酶对猪生产性能、营养物质利用率没有影响。由于不同饲粮中NSP的含量和组成差异较大，而NSP 酶作为生物反应的催化剂，对底物具有专一性，因此，NSP 酶的合理配伍是充分发挥其对饲粮中NSP 降解作用的关键。但是针对不同的饲粮，通过动物试验方法来筛选与之相适应的NSP 酶的配伍，不但工作量巨大，而且结果变异比较大，不能满足实际需求。

近年来，一些研究者通过体外模拟消化的方法来研究饲粮中添加NSP 酶的效果，为高效、快速的优化NSP 酶的配伍提供了一个可行的途径。王恩玲等和何科林等使用胃蛋白酶-胰液素的体外2 步模拟消化法对NSP 酶在家禽饲粮中的作用效果进行了体外评定，取得了良好的促生产效果。Narasimha 等使用体外消化法成功筛选出了纤维素酶、木聚糖酶和β-葡聚糖酶在几种饲料原料中的最佳组合。但是，使用体外模拟消化法优化生长猪不同饲粮NSP 酶谱的研究目前还没有报道。此外，胰液素是含有多种消化酶的复合物，不同批次之间组成有所不同，无法实现模拟肠液的重复以及测试重演性的需求。本实验室前期在研究生长猪小肠液组成的基础上开发了猪模拟小肠液，并在猪饲粮的体外模拟消化上取得了较好的效果。因此，本试验使用基于生长猪生理消化液组成依据的体外三角瓶2 步消化法，在玉米-豆粕型和玉米-杂粕型2 种不同类型的生长猪饲粮中使用6 种NSP 酶，探讨NSP 酶对不同类型饲粮的作用效果，探索优化猪饲粮中NSP酶配伍的方法，为NSP 酶在猪饲粮中的高效使用提供依据。

1材料与方法

1.1 NSP 酶及酶活性测定

选用纤维素酶、木聚糖酶、β-葡聚糖酶、β-甘露聚糖酶、α-半乳糖苷酶和果胶酶6 种NSP酶。纤维素酶活性测定参照NY /T 912—2004，木聚糖酶活性测定参照GB /T 23874—2009，β-葡聚糖酶活性测定参照NY /T 911—2004。β-甘露聚糖酶活性测定采用还原糖比色法，酶活性单位定义为:在37 ℃、pH 5.5 的条件下，每分钟从浓度为3 mg /mL 的甘露聚糖( Sigma G0753) 溶液中降解释放1 μmol 还原糖所需要的酶量，测定波长为540 nm。α-半乳糖苷酶活性测定采用比色法，酶活性单位定义为:在37 ℃、pH 5.5 的条件下，每分钟从浓度为10 mmol /L 的对硝基苯-α-D-吡喃半乳糖苷( Sigma N0877) 溶液中降解释放1 μmol 对硝基酚所需要的酶量，测定波长为400 nm。果胶酶活性测定采用还原糖比色法，酶活性单位定义为:在37 ℃、pH 5.5 的条件下，每分钟从浓度为4 mg /mL 的聚半乳糖醛酸( SigmaP9135) 溶液中降解释放1 μmol 半乳糖醛酸所需要的酶量，测定波长为540 nm。

实测6 种NSP 酶活性值为: 纤维素酶6 867 U/g、木聚糖酶33 290 U/g、β-葡聚糖酶12 076 U /g、β-甘露聚糖酶49 283 U /g、α-半乳糖苷酶2 753 U /g、果胶酶1 129 U /g。

1.2 试验饲粮

本试验于2014—2015 年在中国农业科学院北京畜牧兽医研究所动物营养学国家重点实验室进行。参照NRC(2012)生长猪饲养标准，配制玉米-豆粕型和玉米-杂粕型2 种饲粮，试验饲粮组成及营养水平见表1。参考黄庆华等的方法对饲粮NSP 的含量进行测定，结果见表2。

1.3 体外消化率的测定

1.3.1 试剂的配制

胃缓冲液、小肠缓冲液按照赵峰等的方法进行制备，用KOH 将小肠缓冲液pH 调为7.0，其余组成不变。模拟消化液的制备如下:模拟猪胃液: 称取184.38 kU 的胃蛋白酶( Sigma，P7000) 溶解于250 mL pH 2.0 的胃缓冲溶液中(39 ℃下标定pH)，缓慢搅拌直至溶解( 临用前配制)。

模拟猪小肠液:量取淀粉酶( Sigma，A3306 )60.89 kU，胰蛋白酶(Amersco，0785)19. 00 kU，糜蛋白酶(Amersco，0164)2.39 kU，脂肪酶( Sigma，L3126)919.2 U 溶解于25 mL 去离子水中，并缓慢搅拌直至溶解(临用前配制)。

1.3.2 体外消化法操作过程

准确称取1 g ( 过60 目筛) 饲料样品( 精确至0.000 1 g) ，置于50 mL 三角瓶中，向三角瓶中加入16 mL 模拟猪胃液，小心混合均匀，用封口膜密封。

放于39 ℃恒温水浴摇床中(180 r /min)。准确消化4 h，完成胃期的模拟消化。

完成胃期模拟消化后，打开封口膜，向三角瓶中准确加入4 mL 小肠缓冲液，水浴摇床运行5 min后，加入预先配制的2 mL 模拟猪小肠液。封口膜密封，39 ℃恒温水浴摇床(180 r /min) 中进行22 h 的小肠期模拟消化。取出三角瓶，室温静置30 min，用事先已绝干称重的滤纸(Whatman1541，孔径22 ～ 25 μm)对三角瓶中的消化残渣真空抽滤。将抽滤后的残渣和滤纸置于105 ℃烘箱中烘干至恒重。

1.4 试验设计

采用单因子试验设计，在2 种饲粮中分别添加不同水平的6 种NSP 酶。采用基于猪生理消化液组成的体外三角瓶2 步法( 模拟猪胃液+ 模拟猪小肠液)，通过测定体外干物质消化率( in vitrodry matter digestibility，IVDMD) ，分析各NSP 酶对不同类型饲粮IVDMD 的作用。然后采用六元二次回归旋转正交组合试验设计，进行最佳酶谱组合的筛选。6 种NSP 酶为6 个影响因子，每个因子设置5 个水平，分别用-2.384、-1、0、1、2.384编码酶添加水平，以IVDMD 为指标筛选出最佳酶谱组合。

1.5 数据处理

使用SAS 9.2 软件的GLM 模块分析单一NSP 酶添加水平与饲粮IVDMD 的回归关系。使用六元二次正交回归旋转设计确定各因素的组合，试验数据用SAS 9.2 RSREG 模块进行分析，P＜0.05 为差异显著水平，0.05 ≤ P＜ 0.10 为有显著趋势。

2结果与分析

2.1 玉米-豆粕型饲粮和玉米-杂粕型饲粮营养物质含量和NSP 组成

从表1 可以看出，玉米-豆粕型饲粮的粗蛋白质含量和总能分别为17.2% 和16.46 MJ /kg，与玉米-杂粕型饲粮(17.7% ，16.42 MJ /kg) 比较接近。但是由于玉米-豆粕型饲粮中玉米含量较高，所以其淀粉含量(44.2% ) 高于玉米-杂粕型饲粮(36.8% )，中型洗涤纤维含量(10.5% ) 和酸性洗涤纤维含量(2.8% ) 均低于玉米-杂粕型饲粮的13.1% 和6.1%。

从表2 可以看出，玉米-杂粕型饲粮的总NSP、不可溶性NSP 和可溶性NSP 的含量均高于玉米-豆粕型饲粮。从NSP 的组成来看，玉米-杂粕型饲粮NSP 的大部分组分也高于玉米-豆粕型饲粮，阿拉伯木聚糖是2 种饲粮NSP 的主要组成部分，其次是葡萄糖。

2.2 NSP 酶对玉米-豆粕型饲粮IVDMD 的影响

6 种单一NSP 酶对玉米-豆粕型饲粮IVDMD的影响见表3 所示。在较低的添加水平时，玉米-豆粕型饲粮IVDMD 均随着NSP 酶添加水平的增加而提高，当纤维素酶、木聚糖酶、β-葡聚糖酶、β-甘露聚糖酶、α-半乳糖苷酶和果胶酶的添加水平分别为60、200、80、60、80 和100 μg /g 时，IVDMD 达到最大，不再随着添加水平的提高而上升。

从表4 可以看出，6 种NSP 酶的添加水平与IVDMD 之间都呈现二次曲线关系( P＜ 0.01) ，即IVDMD 不会随着NSP 添加水平的持续升高而一直增加。通过模型计算的各NSP 酶作用下IVDMD最大值和实际测定的最大值均非常接近。不同NSP 酶单一作用时对IVDMD 的提升程度不一，α-半乳糖苷酶对玉米-豆粕型饲粮IVDMD提升程度最大，达到了1.28% ，其次是β-甘露聚糖酶，达到了1.05% ，纤维素酶提升最小，只有0.62%。

2.3 各NSP 酶对玉米-杂粕型饲粮IVDMD 的影响

6 种单一NSP 酶对玉米-杂粕型饲粮IVDMD的影响如表5 所示。与玉米-豆粕型饲粮类似，在较低的添加水平时，玉米-杂粕型饲粮IVDMD均随着添加水平的增加而提高，当纤维素酶、木聚糖酶、β-葡聚糖酶、β-甘露聚糖酶、α-半乳糖苷酶和果胶酶的添加水平分别为100、400、80、300、100 和100 μg /g 时，IVDMD 达到最大，不再随着添加水平的提高而上升。

从表6 可以看出，6 种NSP 酶中除木聚糖酶和β-葡聚糖酶外，添加水平与IVDMD 之间均呈现二次曲线关系(P＜0.01) ，即IVDMD 不会随着NSP 添加水平的持续增加而一直上升。虽然木聚糖酶和β-葡聚糖酶与IVDMD 的二次模型不显著(P＞0.05) ，但是IVDMD 也没有随着这2 种酶添加水平的增加而一直上升。通过模型计算的各NSP 酶作用下IVDMD 最大值和实际测定的最大值也均非常接近。单一NSP 酶作用中，木聚糖酶和β-甘露聚糖酶对玉米-杂粕型饲粮的IVDMD提升作用较大，分别达到了1.95% 和1.90% ，对IVDMD 提升程度最低的是β-葡聚糖酶，只有0.63%。

2.4 IVDMD 与NSP 酶谱回归模型的建立及最佳酶谱组合的筛选

当单一的NSP 酶对饲粮的IVDMD 提升作用达到最大时，即随着NSP 酶添加水平的增加，饲粮的IVDMD 不再继续上升时，选取此时的添加水平为0 编码水平。在玉米-豆粕型饲粮中，使IVDMD达到最大值时纤维素酶、木聚糖酶、β-甘露聚糖酶、α-半乳糖苷酶、β-葡聚糖酶的添加水平分别为60、200、60、80、80 和100 μg /g。在玉米-杂粕型饲粮中，使IVDMD 达到最大值时纤维素酶、木聚糖酶、β-葡聚糖酶、β-甘露聚糖酶、α-半乳糖苷酶和果胶酶的添加水平分别为100、400、80、300、100 和100 μg /g。按照六元二次正交旋转组合试验设计的要求，确定各因素( NSP 酶) 的编码值及相应水平( 表7)。进行不同组合下的体外消化试验，每种饲粮各进行53 组试验。根据体外消化试验结果，建立IVDMD( Y，% ) 与NSP 酶添加水平(X，μg /g) 的六元二次回归方程，回归方程及相关参数见表8。

进一步分析了6 种NSP 酶两两之间的交互作用，结果发现( 数据未列出) :在玉米－ 豆粕型饲粮中，纤维素酶和木聚糖酶(P = 0.013 3)、纤维素酶和β － 甘露聚糖酶(P = 0.050 3)、木聚糖酶和β －葡聚糖酶(P = 0.054 0) 以及β － 甘露聚糖酶和α－ 半乳糖苷酶(P = 0.054 0) 存在正的互作效应或具有协同效应的趋势(0.05 ＜ P ＜ 0.10)。而纤维素酶和β － 葡聚糖酶间具有显著的拮抗作用，表现出负的互作效应(P = 0.014 6)。在玉米－ 杂粕型饲粮中，各NSP 酶之间互作效应的P 值均大于0.10，不存在趋势或显著性差异(P ＞ 0.05)。玉米－豆粕型饲粮和玉米－ 杂粕型饲粮的回归方程均达显著水平( P ＜ 0.05)。说明6 种NSP 酶与IVDMD的函数关系是可用的用此模型进行优化分析获得最佳酶谱组合( 表9)。

对优化出的酶谱进行有效性验证，结果如表10 所示。经过优化后的NSP 酶谱理论上使玉米－ 豆粕型饲粮的IVDMD 达到83.17% ，理论提升3.82% ，实际测定的IVDMD 为82.61% ，实际上提升了3.26%。经过优化后的NSP 酶谱理论上使玉米－ 杂粕型饲粮的IVDMD 达到74.37% ，理论提升3.51% ，实际测定的IVDMD 为74.61% ，实际上提升了3.75%。

3讨 论

3.1 基于饲粮NSP 组成筛选猪饲粮NSP 酶谱的重要性

本试验在实验室前期建立的测定饲粮NSP 含量和组成的方法的基础上，对2 种饲粮的NSP含量和组分进行了测定。从结果可以看出，含有棉籽粕、菜籽粕和甜菜粕的玉米－ 杂粕型饲粮的NSP 含量高于玉米－ 豆粕型饲粮。2 种饲粮NSP的组分包括阿拉伯木聚糖、葡萄糖、糖醛酸、甘露糖、半乳糖和鼠李糖等，岩藻糖的含量很低。猪饲粮中大部分NSP 的降解是在大肠中微生物的作用下发生的，因此，NSP 的抗营养作用会影响营养物质在胃和小肠中的消化吸收。而猪饲粮中NSP 的降解程度与NSP 的溶解度、多糖聚合物的类型以及和细胞壁其他成分结构上的关联程度有关。一些研究发现，NSP 酶可提高猪饲粮干物质消化率、氮的消化率和能量消化率，但是也有一些研究发现猪饲粮中添加NSP 酶对干物质消化率、蛋白质消化率和能量消化率没有影响。由这些文献报道可以看出，NSP 酶对猪的生长性能以及营养物质消化率的影响是不一致的，这种差异很大程度上是由于饲粮的组成和酶的选择不对称造成的。所以，根据饲粮中NSP 的组成和含量，添加与之相适应的NSP 酶种类，可充分挖掘出饲粮的营养价值。

体外模拟消化法以其具有的快速、重复性好以及与生物法相关性高等特点，被一些研究者用来进行NSP 酶作用效果的研究。Bedford 等使用胃蛋白酶－ 胰液素2 步模拟消化法，根据不同水平的木聚糖酶对食糜黏度的影响成功预测了在肉鸡小麦类饲粮中添加木聚糖酶的效果。Malathi等研究了3 种不同菌株产生的NSP 酶对几种饲料原料的体外消化作用的影响，发现不同来源的NSP 酶对饲料原料的黏度和总糖释放量的作用不同。Saleh 等研究了几种单一的NSP 酶对豆粕体外粗蛋白质和干物质消化率的影响，发现果胶酶对豆粕的IVDMD 提升最大。Narasimha等使用体外消化法在确定纤维素酶、木聚糖酶和β － 葡聚糖酶在几种饲料原料中最适添加水平的基础上，进一步针对不同的原料筛选出了3 种NSP 酶的最佳组合。以上研究者使用的体外消化法均是基于Boisen 等建立的以“三角瓶+ 摇床”为测试工具的方法与手段。许多研究发现使用以三角瓶为反应容器的体外酶法测定的饲粮体外消化率与体内消化率之间具有很高的相关性。Boisen 等使用此方法测定的饲粮有机物体外消化率与猪的生物学法测定的表观能量消化率之间的相关系数达到了0.94。Regmi 等使用此方法测定的21 个批次大麦的体外能量消化率与生物学法测定的表观能量消化率之间的相关系数达到了0.81。此外，通过酶法测定猪饲粮的消化能值也已被丹麦、荷兰、法国等发达国家所认同，并成为其新型饲养标准的核心技术。

但是，国内外研究者们普遍使用的胃蛋白酶+ 胰液素的体外模拟消化体系中，胰液素是从猪胰腺中提取的含有多种消化酶的复合物，不同批次胰液素在组成上不是完全相同的，无法实现对模拟消化重演性的需求。此外，针对猪、鸡等不同的动物，均使用胰液素来进行模拟消化，是脱离动物的消化生理依据的。本实验室前期在研究猪消化生理参数的基础上，开发了基于生长猪消化生理依据的模拟猪小肠液，能很好的模拟猪饲粮在动物体内的消化过程，体内外的相关系数在0.95以上。因此，本研究采用“三角瓶+ 基于猪生理依据配制的模拟消化液”来研究6 种NSP 酶对2 种不同类型生长猪饲粮体外消化率的影响。结果表明，2 种饲粮的IVDMD 并不是随着NSP 酶添加水平的增加而一直升高，当NSP 酶的添加水平到一定程度时，饲粮的IVDMD 不再上升，说明NSP 酶的添加有适宜水平的问题，并不是越高越好。不同饲粮中同一种NSP 酶达到临界点时的添加水平也不相同，这是由于不同类型饲粮中NSP的含量不同。2 种饲粮中6 种NSP 酶单独作用时的最适添加水平差别很大，比如玉米-杂粕型饲粮中木聚糖酶的单独最适添加水平为400 μg /g，β-甘露聚糖酶的单独最适添加水平为300 μg /g，而玉米-豆粕型饲粮中木聚糖酶的单独最适添加水平为200 μg /g，β-甘露聚糖酶的单独最适添加水平仅为60 μg /g。因此，根据不同类型饲粮中NSP 的含量和组成的不同，筛选与其相适合的NSP 酶的配伍尤为重要。

3.2 单一NSP 酶的添加对饲粮IVDMD 的影响

不同类型的饲粮由于组成不同，导致其NSP的含量和组成也不同。本试验在研究单一NSP 酶对2 种类型饲粮IVDMD 的作用时发现，玉米-杂粕型饲粮中6 种NSP 酶的最佳添加水平普遍高于玉米-豆粕型饲粮，尤其是木聚糖酶和β-甘露聚糖酶。木聚糖酶的添加使玉米-杂粕型饲粮的IVDMD 提高了1.95% ，高于玉米-豆粕型饲粮的0.68% ，β-甘露聚糖酶的添加使玉米-杂粕型饲粮的IVDMD 提高了1.90% ，也高于玉米-豆粕型饲粮的1.05%。这主要是因为玉米中的NSP含量只有8% 左右，而玉米-杂粕型饲粮中含有菜籽粕、棉籽粕和甜菜粕，而豆粕、菜籽粕和棉籽粕的NSP 含量分别在22%、24% 和30% 左右，甜菜粕中NSP 的含量更是高达65%。从表2 可以看出，玉米-豆粕型饲粮的总NSP 含量为13.29% ，而玉米-杂粕型饲粮的总NSP 含量达到了18.43%。在玉米-杂粕型饲粮中木聚糖含量达到了6.79% ，是其NSP 的主要组成部分，甘露聚糖含量也较高。随着高水平的木聚糖和甘露聚糖的降解，其IVDMD 会有比较大的提升。虽然在玉米－豆粕型饲粮中，木聚糖和葡萄糖的含量较高，但是α-半乳糖苷酶和β-甘露聚糖酶对玉米-豆粕型饲粮IVDMD 提升程度高于木聚糖酶和纤维素酶，这可能是由于酶具有底物专一性，而不同的原料中，NSP 的长链骨架的构成和键型以及交联基团有所差异。这更进一步说明了不能盲目的依据饲粮中NSP 的含量去确定NSP 酶的添加水平。

3.3 NSP 酶谱对饲粮IVDMD 的提升作用

饲粮中的NSP是由其各组分通过多种类型的化学键交联而成的复杂结构，只有使它们之间的相关连接被破坏，才能破坏其抗营养性，发挥饲粮营养潜能。NSP组分和结构的复杂性导致了单一的NSP酶很难充分发挥作用，多种NSP酶的共同作用才有可能有效地降解链式结构，释放营养物质，提高饲粮的营养价值。从本试验结果可以看出，经过优化后的NSP酶谱，其对各自饲粮的IVDMD的提升程度均高于单一酶的作用。这表明6种NSP酶的协同作用，使饲粮中的NSP得到了更充分的降解。Malathi等通过体外消化法测定消化产物的黏度和总糖释放量对几种酶谱组合的效果进行了对比，发现与纤维素酶+木聚糖酶组合以及纤维素酶+木聚糖酶+β－葡聚糖酶组合相比，木聚糖酶+纤维素酶+果胶酶+β－葡聚糖酶组合使豆粕的总糖释放量显著增加。Saleh等研究发现，经过体外2步模拟消化后，纤维素酶、果胶酶、木聚糖酶、葡聚糖酶和半纤维素酶组合作用时玉米－豆粕型饲粮的总糖释放率高于各种酶单一作用时，与本试验的结果也相一致。本试验中，优化后的NSP酶谱对NSP含量相对较高的玉米－杂粕型饲粮的IVDMD提升程度相对高于NSP含量较低的玉米－豆粕型饲粮。赵敏研究发现，NSP酶对蛋鸡玉米－杂粕型饲粮的离体消化能的提升高于玉米－豆粕型饲粮。何科林等研究发现，NSP酶对肉鸡小麦型饲粮的离体消化能的提升也高于玉米－豆粕型饲粮。以上结果均和本试验的研究结果相一致。这是因为NSP酶能显著提高饲粮IVDMD的基础是饲粮中的NSP含量，NSP含量高的饲粮，NSP酶对其消化率的提升作用才会更明显，玉米－豆粕型饲粮的NSP含量(13.29%)低于玉米－杂粕型饲粮(18.43%)，所以NSP酶对其的作用效果略低。

4结 论

①基于猪生理消化液组成依据的胃蛋白酶－模拟小肠液体外2步消化法是快速优化生长猪饲粮NSP酶谱的可行的途径，可为生产上对NSP酶作用效果的初步预判提供帮助。

②在本试验条件下，生长猪玉米－豆粕型饲粮的最佳NSP酶谱组成为:纤维素酶533.6U/kg，木聚糖酶9983.7U/kg，β－甘露聚糖酶4080.6U/kg，α－半乳糖苷酶251.6U/kg，β－葡聚糖酶1014.4U/kg，果胶酶107.3U/kg;生长猪玉米－杂粕型饲粮的最佳NSP酶谱组成为:纤维素酶960.0U/kg，木聚糖酶17177.6U/kg，β－甘露聚糖酶19023.2U/kg，α－半乳糖苷酶307.2U/kg，β－葡聚糖酶405.8U/kg，果胶酶96.9U/kg。

③在本试验条件下，针对2种类型饲粮筛选的NSP酶谱，分别使玉米－豆粕型饲粮的IVDMD提高3.26%、玉米－杂粕型饲粮的IVDMD提高3.75%。

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责编：马维军；审阅：陈达博士

（来源：动物营养学报；作者：高理想,陈亮,张宏福等）