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经常有QC的朋友会遇到检验结果距离预期有较大差距的情况，或者批间差距（波动）比较大的情况，自己也搞不清楚是怎么回事，没准还挨老板（领导）训，“你怎么搞的”、“你做没做过回收率呀”、“回收率都没有问题，检验怎么就出问题了！”等等。有时固然是你检验的问题，有时可能是我准备在第十四章写的检验参数的问题，还有种可能就是回收率在“骗你”。 为什么说回收率会“骗你”，这是因为首先是你先“骗了”它，如果你“骗了”它，那么它偶尔“骗你”一两次也不过分吧。而一旦它“骗了”你，那你以后的检验数据可能就都是骗你和你的老板了。 大家都听说过质量源于设计的说法了，也有人听说过DOE（实验设计）的说法，可能有些人根本就没有意识到自己在“骗”回收率，得到到个“好”的结果就觉得万事大吉，殊不知如果你在设计上有缺陷，那你得到的结果可能就将会是一个“假阳性”。这一点包括CDE也不一定审得出来，曾经发现过ANDA方法验证回收率中有DOE缺陷，CDER也一样没发现，但这都不能说明什么，关键在于你的回收率是做给谁的，如果是做给你自己的，你觉得今后“受骗”的将是谁。 每次开头都说那么多，闲话少说。下面我将举几个例子来说说看，看看大家自己是不是在DOE上存在类似的情况。 1、制剂含量测定 1.1加样回收的必要性 很多人认为加样回收是中药用的东西，西药比较简单，没有必要做加样回收，直接回收就好了；还有人认为，我们API溶解性好，没有必要做加样回收，做起来还特别麻烦。 但制剂技术就是这么牛，它可以把难溶性API变得相对好溶解，也可以把易溶的API搞得溶解性变差，如果你考虑不到这一点，你就把API和辅料直接投到容量瓶里，甚至把API先溶解了再加到容量瓶里，测得的回收率当然就没有问题，但你怎么保证你的片子在测定时也像你的API那么好溶。 我曾经遇到过一个产品，API在水中是易溶的，在醇中也有很好的溶解性，但检测发现溶出度比含量（采用含量均匀度平均值，相当于投片法）高很多，有的批次甚至高10%以上，而且都是HPLC检测的、色谱条件也是一样的。进一步调查发现，该产品含量/稳定性含量波动非常大，而溶出度却相对比较稳定性，尤其是稳定性，有时含量已经“下降了”差不多10%，而溶出度却没有任何变化。你说我该相信哪个？有人说当然要相信含量了，溶出度是个半定量的方法。但此时和更多的时候，我选择了相信溶出度的结果：因为溶出度也是稳定性指示的方法，在样品能够全部溶解的情况下，影响溶出度准确度和精度的主要就是量筒，它的误差要大于量瓶，但影响不会超过2%；而溶出度原液的浓度一般要远远低于含量测定的贮备液的浓度，也就是说其相对浓度会低于含量测定贮备液，即可能有更好的溶解性。因此我做了一个简单的试验：取几批样品在不同时间进行对比试验，分别按正常方法制备供试品溶液（先制贮备液再稀释）和直接加大溶剂体积直接配制成供试液的浓度，分别测定含量，再与溶出度结果进行比较。结果显示，按标准进行的含量测定结果批间差异比较大，但基本上都低于溶出度；而直接稀释法测定的含量结果与溶出度测定结果出奇的一致，且波动性较小。 这就说明了一个道理，制剂在含量测定样品贮备溶液制备中浓度相对较高（其实绝对并不高，80μg/ml，且溶剂中易溶），其中的主成分不能被全部溶解释放出来；而此时如果是API加辅料的话则可能很容易溶解释放出来，这一点对于含有大量黏合剂的缓释制剂中尤其可能，而对于一些特殊剂型例如包埋类的产品，则可能性更是存在。这样如果你采用直接加入法测定的回收率看起来可能非常不错，但是它是在骗你的。所以此时就显示出的结果可能就是回收率很好，但产品的质量比预期要低，而且波动性可能还很大。 这时就显示出加样回收率的优势了：例如一个产品理论含量为100%，测得的含量为90%，那么意味着回收率为90%，而你采用API加辅料测定回收率时回收率为100%，而如果你采用的是一半制剂一半API加辅料的加样回收的方法的理论回收率为（90% 100%）/2＝95%，如果上下各有1%的误差的话，前者回收率的范围是99%～101%，后者的范围是94%～96%，那么即使你回收率的可接受标准是每个样品均在97.0%～103.0%，你也会发现其不符合要求，检验方法有问题。 1.2研磨吸附的影响 其实我遇到过更多的情况是这样的，很多品种的含量均匀度平均值与溶出度的结果是一致的，波动性也很小；而含量测定的结果却明显低于上述两项，而且往往色谱条件也是一致的。与上面的结论是一样的，最终的调查结果是含量测定的结果有问题，含量均匀度与溶出度的检验结果更可信。这在小规格制剂品种是非常常见的。有一次我在给一家企业的研发部门讲检验技术方面的课时，甚至遇到了中间体含量千奇百怪的数据，从80%多到100%，什么样的数都有，制剂人员根本就不敢压片，我就告诉他们，你们直接按照理论片重压就好了（直接压片工艺），不用管检验数据，结果无论是含量还是含量均匀度都与预期是一致的。 QC相对于制剂中间产品的检验来说，更重要的是一种确认；如果你用QC的检验结果作为指导制剂生产（例如折算片重），往往可能会造成灾难性的后果。不管QC人爱不爱听，之前我也不爱听过，但这也是我血的教训得出的结论。事实上也是，发现OOS后调查的结果，原因是由于检验造成的可能不低于80%，剩下可能在10%是取样的问题，不到10%才是生产的问题。当然我会推文中去解释这是为什么、以及怎么去解决。 看到本节的小标题，大家可能也猜到了原因，就是吸附！ 我们国内受药典影响，很多研发人员在检验方法开发时都习惯于采用研磨的方法，而有很多产品，尤其是小规格产品，在研磨的过程中主成分易被研磨工具所吸附，进而造成你称取那部分的样品主成分的含量相对较低，致使最终产品的检测结果偏低，而一旦这样的结果用于指导压片/填充，可能你的含量均匀度或溶出度的结果就不一定高成什么样子了。当然由于吸附的不可控性，你的含量结果也有可能有很大波动，或者接近于预期值或者远离预期值。 在这种情况下，为什么回收率是怎么“骗”我们的呢？道理很简单，你的API是直接加入到容量瓶里去的，这个过程是没有研磨工具去吸附你的API的，所以你可能得到很好的数据！换句话说，你的检测是有研磨过程，而你的回收率验证是没有这个过程的，也就是说，你的验证与你的方法是不一致的！你回收率验证的操作应该是，分别取相当于20片量的API和辅料，置研钵中，研细（时间、力度应与检验一致），再称取规定重量的样品，去配制溶液，再去检测回收率。 还有一点需要说明的是，做回收率不同样品应分别研制，而不要从一个研磨中称取，以避免恰好该研磨过程吸附极少而带来的“假阳性”数据。必要时应考虑不同人员之间的差异。 2、有关物质检验 其实本部分内容在本论坛中已经有过阐述，还是那个要求，你的验证应与你检验方法一致。例如对于特定杂质，你的检验方法是校正因子的方法，而你在回收率验证时采用的是外标法计算回收率，此时的数据就是一个伪数据，因为你杂质的计算方法是不同的，在回收率计算时没有采用校正因子。这也是我当时发现ANDA方法验证中存在的缺陷，但“所幸”的是CDER没有发现。 3、微生物限度检验 3.1纯化水中的微生物 很多人在论坛中问，纯化水微生物限度检验要进行方法学验证吗。 其实道理很简单，你首先要清楚微生物检验方法验证验证的是什么，不外就是通过回收率来确认你的样品本身对菌是否有抑制作用，如果有的话方法就不适用，如果没有的话方法就适用。 那么水本身没有抑菌性是公认的，你还需要验证吗？ 其次，如果水本身有抑菌性的话，那你的培养基中含有95%以上的水，也就是说你一个培养皿里15ml培养基其中有约13ml的水，而你纯化水检验时采用的薄膜过滤法所残留的水也就0.1ml，你13ml的水都不去关心，你却去关心那0.1ml的水？两个皿之间培养基水的量之间差得也不止0.1ml吧！ 第三，也就是最关键的一个。你如果要做回收率验证，那么你采用什么菌种，还是药典中那五种吗？例如中国药典现行版检测的培养基是富营养的营养琼脂培养基，这五种菌在该培养基中均适于生长，你用这五种菌测得的回收率数据当然会非常漂亮，除非你的DOE有问题，但它能代表实际吗？简单的一个实验就会得出结论，用一组纯化水，分别采用营养琼脂和R2A培养基进行检测，可能最终的结果是，用营养琼脂培养基检测的结果几乎都是<1CFU/ml，而用R2A培养基检测的结果可能甚至达到几十CFU/ml！那么此时你的回收率呢，是不是在“骗你”！与其进行回收率试验，不如进行培养基筛选。由于水的来源不同，有些菌适合于低营养下成长，而有些适于富营养下成长。由于水本身营养成分比较低，除非是受污染的水作为原水，所以一般更适用于在低营养培养基下成长，相信这也就是为什么中国药典计划修改纯化水检测用培养基的原因。 3.2表面微生物 那么设备表面的微生物的检验方法需要进行验证吗？ 实际上道理都是一样的。可能我们更关心取样方法本身带来的影响，但实际上这种影响相对于微生物的检验误差是几乎可以忽略的，要知道微生物检验方法甚至在回收率50%～200%都是可以接受的（见USP）。 还有一个重要的原因，就是你设备表面微生物（例如清洁验证）是要求在设备干燥条件下进行的，而如果你去进行验证，那在你涂到设备表面上到表面完全干燥，这个过程可能有些菌已经死去了，这就可能造成验证结果的“假阴性”。 总之，要想你的回收率试验结果不“骗”你，你就要设计好你的检验方法和验证操作，并确保二者在操作方法上是一致的。 |
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