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很多小分子和蛋白与某些特定的疾病紧密相关，被称为疾病的标志物，他们或伴随着疾病的出现而出现，或反映了疾病的严重程度，或映射了疾病的预后情况。如果一个标志物开始有了定量的检测手段，或者在国外该标志物已经应用，想在国内人群中进行验证，亦或者就是想写一篇关于标志物诊断效能的论著，应该如何进行呢？
下面我以两篇顶级杂志的文献为例，从实验设计、数据分析一直到文章呈现的整个过程，结合我自己在研究生期间做的标志物研究的经验，详细说一下此种类型文章的套路。
先简单介绍一下我熟悉的肝癌领域的两篇文章：
第一篇是常规的蛋白标志物在中国人群中的验证，发表在Lancet Oncology，当年影响因子25分，以下简称LO文章。 第二篇是近两年很火的miRNA分子作为肝癌标志物的验证，发表在Journal of Hepatology，当年影响因子9分，以下简称JH文章。 今天这篇主要给大家介绍清楚实验设计，实验设计是文章结论适用范围的前提，也是一个很大的话题。简单来说，就是病例对照研究，但具体操作中，有很多细小的变数。 在进行实验设计前，最先应该考虑的是时向问题，这就面临到底是选择回顾性研究，还是前瞻性研究的问题。 回顾性研究可以做到迅速得到想要的数据，在别人之前发表相关文章，缺点是回顾性研究数据很难做到整齐，组间对比产生的结果会有偏倚，并且实验设计会有很大受限，很难按照最科学的分组进行。但幸运的是，如果有足够的数量，组间偏倚可以通过一些匹配的统计方法来消减，比如广义精确匹配法（CEM）、倾向性得分匹配法（PSM）等。然而，鉴于我们常常研究的是新型标志物，历史患者很可能没有进行相关检测，因此回顾性研究使用的前提是有以前收集储存的血样，最好是有样本库，这样只要有新指标就立即验证。 前瞻性研究的好处是，设计可以很合理，数据可以很整齐，得出的结论可靠性更大。而且同样，组间的其他差异可以通过匹配消除。但前瞻性研究的缺点是周期很长，尤其是如果涉及到多中心的样本收集或者罕见病的病例收集，周期会更长。选择的这两篇文献，没有具体给出是前瞻性还是回顾性研究，在这种情况下基本都是回顾性研究，因为前瞻性研究一般会高调的出来，而且一般都有临床研究的注册号。 另外有两个没有太大争议的地方：多中心数据一般都比单中心数据好，多阶段分析一般都比单阶段分析好。具体的选择哪种方式需要考虑这样几条因素：自己的野心有多大，想投什么级别杂志；标志物的新颖程度如何，如果是独家发现，就一定用自己的单中指心先进行初步探索，之后逐渐拓展合作，多中心化；当然还取决于样本量的多少，能否设计成exploration和validation两个阶段。 病例对照研究的组别设置在本质上就是分成两组，病例组和对照组。但实际上对照组的选择却很有讲究，并不是简简单单的仅健康志愿者对照。分组的选择取决于三个方面：疾病的实际进程，数据分析的侧重点，收集样本的实际情况。例如选取的这两篇文献，都以肝癌为研究对象，但分组上略微有些差异（如图）。 学医的都知道乙肝三部曲或者肝炎三部曲，所以在以肝癌为研究对象的设计中，对照组除了健康对照（healthyvolunteer, HV; healthy control, HC）外，肝炎患者组是必不可少的对照（chronichepatitis, CH; chronic hepatitis B, CHB）；如果探讨标志物对于肝癌的早期诊断效能，那么就可以设置肝硬化（livercirrhosis, LC）组和早期肝癌组。这些设置的设计符合我所说的前两条原则，另外对于JH文章中的HCC组专门又分成了两个亚组，这是因为其中有部分病例没有随访结果，也就是符合前面所说的根据样本的实际收集情况原则。 拓展一下，如果要分析肝癌分级与标志物的关系，那么病例组就要设置不同肝癌分级的亚组；如果研究的是肝硬化或肝纤维化，那么对照组就设置为肝炎和健康，但病例组就可能要分层设置，如不同的纤维化阶段；如果研究肝炎，那么对照组就设置为健康即可，病例组根据具体情况设置成肝炎不同阶段的病人。对于其他的疾病的标志物研究，分组情况以此类推，一般都是按照疾病进展和分级进行设置。 正规来说，各分组的样本量的选择有严格的计算方法，这是为了保证在得出具有统计学差异的同时使用最少的数量。对于前瞻性研究来说，分组后的样本量的选择十分重要，也是在临床研究注册时明确需要填写的信息。这里介绍一个专门计算样本量大小的网站：http:///Calculators。在左边选择进行的实验设计后即可进入计算页面如下图所示，包含一个直接生成样本量的界面和一个计算原理及参考文献的界面。只要将一定设计的参数输入进去之后，就会得出每组需要的样本量。网站还包含了R语言的代码和参考文献，也可以保存起来在R中得出。 对于回顾性研究，情况略有不同，样本量的多少除了按照科学的计算得出之外，更多的还是符合上面的原则，自己野心和标志物的新颖度，还加上一个成本考虑。本例的LO文章选择的标志物是个不是很新颖的标志物，但为了发表在好杂志中，选择了多中心、大样本、多阶段的方式；JH文章样本量适中，因为考虑到标志物较为新颖。现在出现的一些分子标志物，往往是用二代测序的方式获得，成本往往很大，样本量的选择就不得不考虑到这些问题。据我所知，仅仅是提取一次cfDNA，成本就要50-100元，再加上后续的建库、测序费用，成本很高，所以样本量的确定要适时缩减，但务必科学合理。 样本的收集绝对不是一个人的工作，要是涉及到多中心设计，那基本上都是一项大工程，大都是大佬之间的合作。具体到每个单点的工作亦需要医生、护士、样本管理人员、实验员和收样阿姨的配合，所有工作需要在导师的分配下，自己在各个环节协调。 这些由于各科室情况不同，无法具体说明，但在进行时有几点需要考虑。一是人员的分配，二是临床研究注册和知情同意书（很多大牌杂志很看重），三是血样采集工具、时间和次数（不增加病人额外伤害为原则；采血管是否自己准备？是不是采集多个时项点？），四是血样处理时间和流程（全血？血浆？血清？需不需要立即离心？需不需要抽提某些分子），五是血样储存地点和条件（常温？-20度？-80度？），六是病人住院信息的采集（距离采集点最近的检验数据和基本信息，没有信息的样本是无用的样本；采集之前考虑好需要的信息列成Excel表格，一次性采集完）。 完成上述工作之后，接下来就是开始检测标志物，整理相关数据了。 |
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