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科技日报记者 张佳星 8月10日，《科学》在线刊发施一公团队研究成果，首次解析了人源多囊蛋白1与多囊蛋白2形成的复合物的结构，分辨率达到3.6Å（埃，10的-10次方），核心区域分辨率达到3.2Å。（注：3Å级别的分辨率可观察盐桥和氢键等，对药物设计具有指导意义。） PKD1和PKD2是多囊肾病的致病基因，发生突变后将致病，使得患者肾中会出现囊肿，体积大小和数量不断增加。多囊肾病是最常见的常染色体显性遗传疾病之一，发病率约为1-2.5‰。由于它为单基因疾病，因此治疗靶点清晰。 2003年一篇题为《常染色体显性遗传性多囊肾病研究的热点问题》的论文中显示，该病的研究热点在于致病基因表达产物，即多囊蛋白1和多囊蛋白2的结构与功能、亚细胞定位等，以阐明多囊肾病的分子发病机制，实现临床彻底治愈。 15年后，该蛋白家族的精细结构终于由清华大学教授施一公团队解出，其中的多囊蛋白1是拥有4302个氨基酸包含11次跨膜螺旋的蛋白。在蛋白质解析的研究过程中，冷冻电镜的“洪荒之力”经常备受关注，然而在实际研究过程中，电镜“放眼”透射前其实存在着大量待攻克的难关。“通过冷冻电镜获得蛋白质的结构，必须先获得足够量且性质均一的蛋白质。”8月11日，论文作者之一的王廷亮博士告诉科技日报记者，“上镜”前的准备工作耗时5年。 A.人源PKD1和PKD2蛋白的拓扑结构示意图。B.人源PKD1和PKD2蛋白复合物结构；C.人源PKD1独特的通道结构域。 系统摸索 获得够用的体外蛋白 对于结构生物学家来说，测试蛋白经常在量上捉襟见肘。用来研究的蛋白质为人源蛋白，很难直接从人体组织中富集提取而出。怎么办呢？ 他们通过已知的基因序列将基因在原核生物中（例如大肠杆菌）进行克隆，获得大量的基因拷贝后，通过病毒载体等方式，通过侵染的方法转入到常用的工具细胞中进行表达。培养大量的工具细胞，就有可能富集到目标的蛋白质。 然而，对于工具细胞来说，这些外来基因怎么能表达得好呢？这就需要进行大量的重复性工作，为目标基因（PKD1和PKD2）寻找最优的表达系统。“如通过基因编码的优化，可提高蛋白的表达量，从而拿到体外重组蛋白质。”王廷亮说。 经过优化的基因表达系统转入细胞后，这些带有目标基因的工具细胞将在培养液中大量培养。此时，目标蛋白仍旧在细胞中，如何将目标蛋白从复杂的细胞中“钓”出来？仍旧需要大量的提取条件摸索，如尝试和筛选了大量的去垢剂、确定蛋白边界等，以做到“不错杀一个、不漏网一千”的数量和质量上的平衡。 在经过了大量的实验摸索之后，课题组获得目标蛋白却仍旧非常珍贵稀少。“50升的细胞只能提取出100微克左右蛋白。”王廷亮表示，这些蛋白只够完成3-5次的冷冻电镜样品的制备，而能够符合电镜数据收集要求的样品往往只有1到2个。 蚂蚁搬家 高精度“反推”巨型蛋白分子结构 蛋白“上镜”后，需要长时间的运转和巨量的信息处理。对于超大结构的蛋白质来说，研究者将收集到倍数增加的大量数据，再通过计算进行结构的再现。 冷冻电镜通过发射电子、并测定电子通过蛋白质分子后轨迹变化的方式，达到蛋白质结构Å级精度地呈现。其每次扫描的视域非常狭小。一个“镊子尖”大小的小金片（直径约2毫米），会被分为大约200个左右的均匀小孔，每个小孔中再分150个小孔，电子束一次只“看”其中一个小孔。整个蛋白质三维结构的成型犹如蚂蚁搬家，在获得大量的多角度的二维图片后，由后期的三维重建系统对图片数据进行计算和重构，并通过可视化系统形成蛋白质三维结构的示意图。 最终，施一公团队获得了多囊蛋白1和多囊蛋白2形成了独特的一比三的复合物结构，并对该结构和生化数据进行了要进一步的分析。研究组发现二者在没有蛋白C端卷曲螺旋结构域的情况下仍能形复合物。 得出清晰结构 对多囊肾发病机制提出新观点 研究人员还发现多囊蛋白1中存在区别于传统电压门控离子通道（细胞膜内外跨膜电位的变化能够开启、关闭的离子通道）的结构特征，暗示了多囊蛋白1和多囊蛋白2形成的复合物不利于钙离子的通透。 论文第一作者宿强解释，“多囊肾研究领域内对这两个蛋白是否形成钙离子通道一直存有争议，该结构不支持复合物为钙离子通道的假说，给多囊肾病发病机理带来全新思考。” 除此之外，该复合物结构也刷新了结构生物学家对电压门控离子通道类似折叠“长相”’的认识。之前报道的大多数离子通道类似折叠结构或者是同源四聚体，或者是单链的假四次对称体，这个却是两个蛋白组成的一比三的复合物。 “有意思的是其中一个蛋白自己单独也能形成四聚体。这种独特的结构意味着不同的工作机理和调控方式。丰富了结构生物学家对电压门控离子通道类似折叠蛋白组装的理解。”宿强说。 由于无论PKD1还是PKD2突变，多囊肾病患者的临床表现及病理改变都相似。因此二者的基因突变应是通过同一途径致病，即“协同合作”。在此之前，学界对多囊蛋白1和多囊蛋白2的“协作”模式有4中猜测，分别为：位于不同位置，远程作用，产生信号传至细胞核；同位于细胞膜上，直接相互作用，多囊蛋白2发挥钙离子通道作用引起信号转导；多囊蛋白1主要作用，2从旁监督；二者共同激活第三方通路，挟持细胞的发育。随着结构的清晰，对于“协作”模式的猜测将很快有更加明确的答案，给多囊肾病的机制研究带来有益的参考。 来源：科技日报 文中图片由作者提供 |
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