实时荧光定量PCR原理
PCR是1985年开始出现的一项基因检测技术,由于PCR技术具有简便易行、灵敏度高等优点,该技术被广泛应用于基础研究,成为分子生物学必不可少的研究工具。但在许多情况下,研究者们已不再满足于得知某一特异DNA序列的存在与否,他们更着眼于对其进行精确的核酸定量。因而,借助PCR对基因快速、敏感、特异而准确的定量成为目前分子生物学技术研究的热点之一。实时荧光定量PCR(
real-time quantitative PCR, RQ
PCR)技术实现了PCR从定性到定量的飞跃,它以其特异性强、灵敏度高、重复性好、定量准确、速度快、全封闭反应等优点成为分子生物学研究中的重要工具。本章就此技术及其应用进行详细的介绍。
一、引言
传统的PCR定量是应用终点PCR来对样品中的模板量进行定量,通常用凝胶电泳分离,并用荧光染色来检测PCR反应的最终扩增产物。但在PCR反应中,由于模板、试剂、焦磷酸盐分子的聚集等因素影响聚合酶反应,最终导致PCR反应不再以指数形式进行而进入“平台期”,而且一些反应的终产物比另一些要多,因此终点PCR反应方法定量并不准确。此外,终点PCR还容易交叉污染,产生假阳性。
1996年,实时荧光定量PCR技术由美国
Applied
Biosystems公司首先推出。所谓实时荧光定量PCR是指在PCR指数扩增期间通过连续监测荧光信号出现的先后顺序以及信号强弱的变化来即时分析目的基因的拷贝数目,通过与加入已知量的标准品进行比较,可实现实时定量。实时定量PCR技术较之于以前的以终点法定量PCR技术具有明显的优势。首先,它操作简便、快速、高效,具有很高的敏感性和特异性;其次,在封闭的体系中完成扩增并进行实时测定,大大降低了污染的可能性。实时定量PCR技术的出现使分子诊断领域发生重大的变化,目前已广泛地应用于mRNA表达的研究、DNA拷贝数的检测、单核苷酸多态性的测定、细胞因子的表达分析、肿瘤酎药基因表达的研究以及病原体感染的定量监测等。
二、概念及原理
(一)两个重要的概念
1.荧光阀值
荧光阈值( threshold)是在荧光扩增曲线指数增长期设定的一个荧光强度标准(即PCR扩增产物量的标准)。
PCR反应过程中产生的DNA拷贝数是呈指数方式增加的,随着反应循环数的增加,最终PCR反应不再以指数方式生成模板,从而进入“平台期”。在传统的PCR中,常用凝胶电泳分离并用荧光染色来检测PCR反应的最终扩增产物,因此用终点法对PCR产物定量存在不可靠之处。在实时荧光定量PCR中,对整个PCR反应扩增过程进行了实时的监测和连续地分析扩增相关的荧光信号,随着反应时间的进行,监测到的荧光信号的变化可以绘制成一条曲线。在PCR反应早期,产生荧光的水平不能与背景明显地区别,而后荧光的产生进入指数期、线性期和最终的平台期,因此可以在PCR反应处于指数期的某一点上来检测PCR产物的量,并且由此来推断模板最初的含量。为了便于对所检测样本进行比较,首先需设定一个荧光信号的阈值(见图4-1)。
荧光阈值是在荧光扩增曲线上人为设定的一个值,它可以设定在指数扩增阶段任意位置上。一般荧光域值设置为3~15个循环的荧光信号的标准偏差的10倍,但实际应用时要结合扩增效率、线形回归系数等参数来综合考虑。
循环阈值( cycle threshold value,C)即PCR扩增过程中扩增产物的荧光信号达到设定的荧光阈值时所经过的扩增循环次数(见图4-1)。C值与荧光阈值有关
实时荧光定量PCR方法采用始点定量的方式,利用C1的概念,在指数扩增的开始阶段进行检测,此时样品间的细小误差尚未放大且扩增效率也恒定,因此该C值具有极好的重复性。从图42的重复实验中可以看出,尽管平台期的DNA拷贝数波动很大,C1值却是相对固定的。
对于一个理想的PCR反应,X（n）=X（0）×2^n;对于一个非理想的PCR反应,
X(n)=x（0）（1+E（n））^n
其中n为扩增反应的循环次数;X(n)为第n次循环后的产物量;X(0)为初始模板量;E(n)为扩增效率。在荧光定量PCR反应中,在扩增产物达到阈值线时,
X(Ct)=X（0）（1+E（n））^Ct=N
X(Ct)为荧光扩增信号达到阈值强度时扩增产物的量,在阈值线设定以后,X(Ct)是一个常数,将其设为N两边同时取对数,得
lgN=lgX（0）（1+E（n））
整理此式,得
lgX(0)=-Ig(1+E(n)) Ct+lgN
Ct=-1/Ig(1+E(n)) *lgX(0)+lgN/lg(1+E(n))
对于每一个特定的PCR反应来说,E(n)和N均是常数,所以Ct值与lgX(0)成负相关.也就是说,初始模板量的对数值与循环数Ct值呈线性关系,初始模板量越多,扩增产物达到阈值时所需要的循环数越少。因此,根据样品扩增达到阈值的循环数就可计算出样品中所含的模板量
