【技术专题】Western Blot实验操作及选购指南-4

Western Blot实验操作及选购指南（四）

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封闭及免疫杂交

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为了防止抗体和膜非特异性的结合，要将除目的蛋白外其他无结合蛋白位置封闭起来，防止后面一抗非特异性结合产生较深背景。常用封闭物有脱脂奶粉和 BSA（稀释于不同的缓冲液中），但不同的抗原-抗体反应，封闭条件均不相同。

封闭后，目标蛋白便与特异性的一抗进行免疫反应，一抗可以是标记的，也可以是非标记的。标记的一抗与免疫原结合后，可直接进行检测（直接法），降低了背景和非特异性结合，但信号较弱。非标记的一抗配合标记的二抗使用（间接法），对信号有级联放大作用，可以增加灵敏性和信噪比。二抗既可标记放射性同位素，也可标记染料或其他分子，或与酶偶联。常用的酶包括碱性磷酸酶（AP）和辣根过氧化物酶（HRP），通过与底物反应产生光信号。

封闭及免疫杂交流程

1. 用适量的TBS/PBS洗已经转好的膜，室温，放到摇床上晃动。

2. 将膜置于约25 ml封闭缓冲液中1 h，室温，置于摇床上晃动。

3. 15 ml TBS/T或PBS/T洗膜三次（每次约5 min）。

4. 加入稀释过的一抗，室温孵育1~2 h或4 ℃过夜，缓慢晃动。

5. 用15 ml TBS/T或PBS/T洗膜三次（每次约5 min）。

6. 加入稀释过的二抗，室温孵育1 h，缓慢晃动

7. 用15 ml TBS/T或PBS/T洗膜三次（每次约 5min）。（注:最后一次要用不含Tween的溶液清洗）    

注：实验的条件可根据实验情况进行调整。

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生工相关产品——抗体

生工抗体种类齐全：

• 标签抗体：HIS，GST，FLAG，HA，MYC，GFP等高性价比抗体。

• 内参抗体：ACTB（动物），ACTIN（植物），GAPDH，TUBB3，HIST1H3A（核内参）等高质量抗体。

• 一抗：P53，BCL2，ERK1/2，EGF，TNF等两万种人类蛋白抗体。

• 二抗：多种标记 HRP,Biotin，AP，FITC，PE，Cy5，Alexa Flour 488，TRITC 等，抗多种属人，兔，大鼠，小鼠，猪，鸡等全套二抗。

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显色、显影

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显影的方法包括化学发光法以及生色底物显影法进行实验，并通过胶片或影像系统（CCD）收集。因为二抗上标记分为有HRP（辣根过氧化物酶）以及AP（碱性磷酸酶），两种二抗可供选择的方法也不同。

• 标记HRP（辣根过氧化物酶）的二抗：

化学发光底物：一般使用ECL发光法进行实验，ECL中含有H2O2和鲁米诺，在HRP（辣根过氧化物酶）的作用下，发出荧光来。

生色底物：HRP的生色底物显影有DAB，4-CN ，CN/DAB，AEC和TMB等。

• 标记AP（碱性磷酸酶）的二抗：

AP的生色底物：BCIP，NBT和INT。

以DAB显影标记HRP的二抗步骤

1. 经二抗标记及清洗过的膜放在阴暗处。显影前，配置新鲜的DAB显影液并充分混匀。

2. 在阴暗处将显影液加入膜上，将膜覆盖。37℃低速震荡反应10 min左右即可。这时浅棕色的条带出现。

3. 倒掉反应液，双蒸水冲洗条带3~4次，自然干燥。照像记录实验结果。

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膜的再生

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在 Western Blot 中，如果要使用Actin、Tubulin 等表达量相对稳定的蛋白作为参照，或检测其它蛋白进行比较。通常情况下，可以在染膜过程中将印记膜进行裁剪，将目的蛋白与内参蛋白分开，分别孵育不同的抗体。

也可以通过使用蛋白印迹膜再生液中特殊成分解离一抗二抗与印迹膜上抗原的结合从而去除一抗二抗，即可非常方便地重新利用同一张膜检测其它蛋白。

与重新跑一个 SDS-PAGE 胶比较，不仅省时省力，而且可以消除重新上样而带来的误差，使可比性更强。操作简单快速，室温进行，最快 20~30 min 就可以完成全过程。

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