抗体Fc区域优化大揭秘，这其中到底有什么秘密？

yangtz008 2018-08-18

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抗体 Fc 区域与 FcγRIII (CD16) 结合力检测

Fc 受体（Fc Receptor, FcR）是表达在特定免疫细胞表面，用于识别抗体Fc区域介导免疫应答的免疫球蛋白。抗体Fab区域识别侵染源抗原后，其抗体Fc区域与免疫细胞上的Fc受体结合，启动免疫细胞的应答功能，如吞噬及细胞毒杀伤等，对侵染源进行破坏清除。根据Fc受体识别抗体类型及表达细胞的不同，Fc受体主要分为FcγR、FcαR和FcεR三种类型，FcγR又可分为FcγRI（CD64）、FcγRII（CD32）、FcγRIII（CD16）和FcRn（Neonatal Fc receptor）四种亚型。通过改造Fc区域的氨基酸序列或糖基化，可提高/降低抗体对Fc受体的亲和力，从而改善抗体功效及半衰期。

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FcγRIII (CD16)在不同细胞类型中具有高度同源的FcγRIIIa和FcγRIIIb两种亚型，其中FcγRIIIa对IgG 抗体Fc区域具有中/低亲和力，参与细胞吞噬、炎症介导、抗体介导细胞杀伤（Antibody Dependent Cellular Cytotoxicity， ADCC）和肥大细胞脱粒及清除等免疫应答过程。在FcγRIIIa人群中存在一个单核干多态性（SNP）位点引起的高亲和力(176Val/V158) 和低亲和力(176Phe/F158) 两个亚型，当这两种亚型形成纯合子时，可能会引起自身免疫性疾病或干预IgG抗体的治疗过程，因此FcγRIIIa是一个非常重要的治疗靶点。

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针对高亲和力(176Val/V158) 和低亲和力(176Phe/F158)两个亚型，使用高灵敏度均相免洗AlphaLISA检测方法，通过竞争性实验设计，可以快速评价人源IgG抗体Fc区域对人源FcγRIIIa两个亚型的亲和力及选择性，为抗体Fc区域的进一步优化改造提供重要数据参考。2017十大畅销药物之一Transtuzumab/Herceptin通过提高FcγRIIIa亲和力增强ADCC活性，同时对FcγRIIIa158F多态性的“低应答患者”在使用强化抗体可能产生更有效的治疗应答。

抗体 Fc 区域与 FcγRI(CD64)和 FcRn 结合力检测

FcγRI (CD64)对IgG的Fc区域具有最高的亲和力，也能通过胞内免疫受体酪氨酸激活区域活化后调控免疫应答过程。而对于治疗性单抗，如PD1/PD-L1免疫检验点靶点等，需要降低Fc区域与Fc受体的结合，从而降低对T细胞的ADCC/ADCP/CDC毒副作用。使用AlphaLISA Tool Box定制化方案（如下图A-C），采用His标签FcγRI和生物素IgG抗体，通过竞争性实验设计，评价不同亚型的IgG抗体Fc区域与FcγRI亲和力。

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抗体Fc区域还能够以PH依赖的方式结合新生Fc受体（FcRn），避免抗体被细胞核内体降解，从而延长单抗的半衰期，因此通过Fc改造增强其与FcRn的亲和力及PH选择性，延长其半衰期，对于改进给药频率及降低成本都有重要意义。Genentech公司生物制药团队在2015年Journal of Immunological Methods杂志上发表的文章中，使用高灵敏度均相免洗Alpha技术，建立了快速可靠的单克隆抗体Fc区域与FcRn结合检测平台，用于评价不同亚型IgG抗体及其突变体的Fc区域亲和力改变的构效关系。

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[Development and applications of AlphaScreen-based FcRn binding assay to characterize monoclonal antibodies. 2015. Journal of Immunological Methods.]

抗体 Fc 区域优化及糖基化修饰

Amgen生物制药研发团队在2016年Biotechnol. Prog杂志上发表文章的所述，抗体糖基化是造成抗体药物异质性的主要原因。IgG单抗CH2区域存在N-糖基化位点，该位点不同的糖基化状态（如右图），会影响IgG抗体Fc区域与FcR受体的结合能力，从而导致单抗药物治疗过程中免疫系统对肿瘤细胞的杀伤作用受到影响，如ADCC及CDC等。文章中使用FcγRIIIa AlphaLISA试剂盒，评价不同糖基化抗体Fc亲和力，并研究其ADCC及CDC活性的相关性。

Masayoshi Onitsuka等人2015年在.Journal of Bioscience and Bioengineering杂志上发表了一种快速检测N-糖基化的新方法，如下图所示，该方法使用AlphaLISA检测平台，根据不同类型的凝集素（Lectin）与不同糖基特异性配对结合，通过 Alpha Signal信号值的改变，实时动态快速判断CHO HcD6-SF细胞不同培养条件下，IgG1抗体�Fuc、Galß4GlcNAc和ßGlc-NAc三种类型糖基化的时间动态曲线。