T细胞一旦被激活，就开始快速增殖，众多与效应应答、支持功能相关的基因表达也会随之改变。随后就是消退期，大部分活化的T细胞死亡，只剩下少数抗原特异性T细胞转化为多种长存的记忆T细胞，以便能够在未来遇到相似抗原时再次快速激活。伴随着T细胞活化和随后的记忆形成，细胞表面蛋白表达也随之改变，因此通过这些蛋白变化，可区分出T细胞亚群并鉴定其活化或记忆状态。
OMIP系列的第31个标准化方案，是一个16色方案，可检测C57BL/6小鼠T细胞的活化状态、效应功能状态，同时检测表面上4种免疫检查点蛋白的表达量,因此是一个较完整的免疫检查点方案。
方案
在此说明一下其中的CD45.2。CD45.1和CD45.2是CD45的等位基因变种，在不同小鼠中表达不同，例如C57BL.6和Balb/c是CD45.2，FVB是CD45.1。那么为什么不用CD45呢？因为他们下一步还需要进行同源移植/输注操作，所以作者在此选择了CD45.2。大家平时如果无此需求，可用CD45代替。
设门步骤
1、通过FSC-W/FSC-H、SSC-W/SSC-H排除粘连体，然后通过DAPI/SSC排除死细胞，接着通过FSC/SSC选取淋巴细胞群体，再选择CD3＋T细胞，最后通过CD4/CD8分别选择CD4＋辅助T和CD8＋细胞毒T进行分析。
2、通过KLRG1/CD127可区分出T细胞中SLEC和MPEC两类新近发现的效应T细胞：SLEC即Short-lived effector cells，弱表达CD127、高表达KLRG1；MPEC即Memory precursor cells，高表达CD127、弱表达KLRG1。通过CD44/CD27或CD45RA/CD62L可区分出初始T、中央记忆、效应记忆、效应T细胞。图中红色散点是正常小鼠脾脏细胞，蓝色为MC-38肿瘤浸润淋巴细胞。
3、最后当然是重头戏，分析各类细胞上的PD-1、LAG-3、TIM-3、CTLA-4四个免疫检查点蛋白表达情况，由于表达量均不高，所以FMO的设置非常重要。
同样，红色曲线是正常小鼠脾脏细胞，蓝色曲线为MC-38肿瘤浸润淋巴细胞。
这个方案是小鼠的，但只需将其中各个抗体换成人的，就可以用在人样本上。免疫检查点药物在临床上应用研究也是火爆异常，你不试试？
参考文献：Nemoto S, Mailloux AW, Kroeger J, Mulé JJ. OMIP-031: Immunologic checkpoint expression on murine effector and memory T-cell subsets. Cytometry A. 2016 May;89(5):427-9. doi: 10.1002/cyto.a.22808.
