带你了解磷酸化

蛋白质的磷酸化？？？

蛋白质磷酸化是一种重要的蛋白质翻译后修饰。在细胞中，大约有1/3的蛋白质是经过磷酸化修饰的；人类基因组中，约有2%的基因编码了500种激酶和100种磷酸酶。

目前，蛋白质磷酸化的分析和磷酸化位点的鉴定已成为蛋白质翻译后修饰研究的热点。

1min带您初步了解磷酸化

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Q1. 什么是蛋白质磷酸化呢？

A：蛋白质磷酸化是在蛋白质激酶催化下，把ATP的磷酸基转移到其他蛋白质氨基酸残基。

（磷酸根带负电荷，磷酸化会改变原有的构象，进一步影响蛋白质的活性）

Q2. 什么是蛋白质的去磷酸化呢？

A：上述磷酸化的蛋白在蛋白磷酸酶的作用下去磷酸化，这个过程是可逆的。

Q3. 磷酸化主要的氨基酸残基是谁呢？

A：蛋白质磷酸化主要发生在两种氨基酸上，丝氨酸（Ser）和苏氨酸（Thr），其次还有酪氨酸（Tyr）。

Q4. 蛋白质磷酸化的作用？

A：蛋白质磷酸化和去磷酸化是原核和真核生物细胞表达调控的关键环节，对许多生物的细胞功能起开关调控作用，调节着细胞信号转导、细胞分化和细胞生长等几乎所有的生命活动过程，是一种普遍的调节机制。

细胞内信号蛋白主要分为两大类：1. 蛋白激酶的作用下磷酸化，共价结合ATP所提供的磷酸基团；2.在信号作用下结合GTP，通常以GTP取代GDP。

两种胞内信号蛋白的共同特征是，在信号达到时通过获得一个或几个磷酸基团而被激活，而在信号减弱时能去除这些基团，从而失去活性。

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WB检测磷酸化蛋白往往令人很是困扰，我们平台总结了一些经验，小伙伴们赶紧搬个小板凳认真学起来。

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1：新鲜样本 

磷酸化指标不稳定，最好在取样后的1周内进行实验（最长不要超过1个月）。

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2：低温处理 

磷酸化蛋白在室温条件下很容易降解，建议取样后液氮速冻，然后再放入-80℃冰箱，样品处理全程低温。

3：加PMFS 

组织/细胞裂解时会释放出大量内源性蛋白磷酸酶，催化磷酸化蛋白的去磷酸化，需要在裂解液中加入蛋白酶抑制剂和磷酸酶抑制剂PMFS，维护蛋白质的磷酸化状态。

注意：PMFS新鲜配置（其他试剂→氟化钠NaF：抑制酸性磷酸酶; 正钒酸钠Na3VO4：抑制碱性磷酸酶和酪氨酸磷酸酶；焦磷酸钠Na2P2O4：抑制丝氨酸-苏氨酸磷酸酶）

4：BSA封闭 

脱脂奶粉中含有酪蛋白（一种磷酸化蛋白），有可能产生非特异性结合，容易产生高背景，建议用BSA封闭。

5：抗体孵育

抗原/抗体是非共价结合，在膜上为物理性吸附，这种吸附高温下会变弱，容易脱落，磷酸化蛋白只占总量的极少部分，4℃过夜可保证充分结合进而曝出更漂亮的条带。

6：设置对照

普通内参作为体系对照，保证上样量一致；总蛋白抗体也必不可少，磷酸化蛋白与总蛋白比值变化才能真正说明问题，而不是单一看磷酸化蛋白的表达；适当考虑抗体的阳/阴对照，确定抗体的特异性信号。

7：荧光双染

磷酸化蛋白和非磷酸化蛋白分子相近，可采用2种荧光二抗同时检测，结果更准确，同时节省时间和样品。

蛋白磷酸化发挥功能后，去哪里了呢？

去磷酸化 or 降解？

信号通路依靠信号蛋白上磷酸基团的传递，一般为多级激酶模式，磷酸化激酶作用于下游蛋白（可能是激酶/转录因子），将磷酸基团传递给下游蛋白，使其磷酸化，同时又会被上游激酶磷酸化；从表观上来看，通路激活时，某蛋白的磷酸化水平居高不下，可保持一段时间，甚至可以认为磷酸化程度越高，通路激活越充分，发挥作用后再去磷酸化。

如果有某些特定的信号蛋白是发挥作用后降解的，也是有可能的，但尚不清楚有还是没有，这里所说的是普通的信号蛋白的工作原理，具体研究还需查询更多资料、深入探讨。