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转载请注明：解螺旋·临床医生科研成长平台 Journal of Visualized Experiments (JOVE，最新影响因子1.184)视频实验期刊在生命医学科学领域出版了诸多实验视频，为可视化学习提供了平台。胶质细胞是脑内的重要细胞，2018年6月5日，亚利桑那大学的研究者在JOVE发表了一篇有关ImageJ分析小胶质细胞形态学的文章，文章题为“Quantifying Microglia Morphology from Photomicrographs of Immunohistochemistry Prepared Tissue Using ImageJ”。 文章链接为：https://www.ncbi.nlm./pmc/articles/PMC6103256/。 该链接下操作视频（63M，MP4格式）点击Download可免费下载： 小胶质细胞（Microglia）是中枢神经系统内固有免疫效应细胞，在脑内发挥着及其重要的作用。首先，小胶质细胞对于神经系统的正常发育是必需的。在大脑发育的早期阶段，约20%～80%具有长投射轴突的神经元发生凋亡并迅速被清除，激素、神经递质或分泌的蛋白质等细胞外信号可与神经元上的特异性受体结合，促进神经元的存活或启动神经元发生程序性细胞死亡，从而对中枢神经系统内神经元的数量进行调控。 小胶质细胞的形态具有高度可塑性，与其生物学功能状态密切相关。正常情况下，小胶质细胞呈高度分枝状，具有三级和四级分枝结构，且细胞间的分枝很少发生重叠。分枝状的小胶质细胞通常被称为“静息小胶质细胞”。 当脑内发生炎症、感染、创伤或其他神经系统疾病时，小胶质细胞迅速被激活并获得吞噬功能。小胶质细胞激活的定义最初主要是基于其形态学的变化。 激活的小胶质细胞胞体增大、突起变短、细胞形态呈圆形或杆状；活化的小胶质细胞进一步被激活和调整，细胞突起消失、细胞形态呈阿米巴状，并具有吞噬功能。小胶质细胞的形态学改变反映小胶质细胞的活化状态，而小胶质细胞的活化状态与脑内受损部位的严重程度密切相关。小胶质细胞可以作为大脑中不同细胞功能和功能障碍的评价指标，对于小胶质细胞形态学的定量显得尤为重要。 ImageJ是美国NIH开发的一款功能强大的免费软件，广发应用于医学图像分析。Fiji（Fiji is just ImageJ）是预装了诸多生物学插件的ImageJ。 下载地址为： https:///Fiji/Downloads 。 用户可根据电脑系统自行下载： 今天给大家分享如何使用ImageJ对小胶质细胞形态学进行分析。 上图是Iba1组织化学染色的小胶质细胞，Iba1是小胶质细胞的Maker，我们使用Iba1染色来显示小胶质细胞形态。在此推荐一个好用的抗体查询网站：https://www./ 。 该网站含有来自183个供应商的4030885个抗体，总引用次数高达1470697次。我们输入Iba1： 可知Iba1文献中使用引用次数最多的来自Abacam的货号为ab5076的抗体，一般引用次数越高的抗体质量越好。我们还可以根据以下条件对需查找的抗体进行筛选： 言归正传，接着分享如何使用ImageJ分析小胶质细胞形态学。 整个分析过程流程图如下： 详细步骤如下： 1、从https:///Fiji/Downloads下载Fiji，对于AnalyzeSkeleton(2D/3D)插件下载：http:///AnalyzeSkeleton 。将下载插件放置于Plugins文件夹下重启软件即可。 注意：将显微照片转换为二元骨架图像的整个过程只需不到1分钟。 2、如果使用荧光显微照片，请确保图像为8-bit并转换为灰度以最佳地显示所有阳性染色。依次点击：Image | Lookup Tables | Grays。如果使用DAB明场照片，使用FFT bandpass filter plugin滤波，依次点击：Process | FFT | bandpass filter，然后转化为灰度图片。 3、如果图像太暗，则无法显示小胶质细胞的所有突起，请调整亮度和对比度。依次点击：Image | Adjust | Brightness/Contrast。根据需要调整最小或最大滑块直至显示效果符合预期。
4、运行Unsharp Mask filter以增加对比度，依次点击：Process | Filters | Unsharp Mask。此操作ImageJ设置为(a pixel radius of 3 and mask weight of 0.6)。
5、执行去除斑点（Despeckle）步骤，以消除由钝化面罩产生的椒盐噪音。依次点击：Process | Noise |Despeckle。 6、将图片转换为二进制图像，依次点击：Image | Adjust | Threshold。阈值选定后点击Apply。
7、在生成的二进制图像中可能存在单像素背景噪声，因此应用despeckle, close, remove outliers function处理。 despeckle function依次点击：Process | Noise | Despeckle； close function依次点击：Process | Binary | Close； remove outliers function依次点击：Process | Noise | Remove Outliers。 8、将获得图像保存以供后续进行分析，通过Process |Binary | Skeletonize骨骼化图像。下图是骨骼化之后的小胶质细胞的突起：
9、选择骨架化图像，然后单击插件AnalyzeSkeleton（2D / 3D）分析骨架，并检查分支信息。依次点击：Plugins | Skeleton | Analyze Skeleton。可得到诸多结果：
例如分支点数量：
分支末端的数量：
突起的平均长度
最长突起的长度
每个分支的长度
以及总长度等等。 我们可对细胞的Endpoints/cell以及Process length/cell进行统计：
该方法稳定性好，不同的使用者（User1和User2）能够得到类似的结果：
上述ImageJ分析小胶质形态的优点是具有普遍适用性且分析速度快、简单易学。骨架分析提供了对多个细胞的分析，使用AnalyzeSkeleton评估细胞分枝很快并适用于整个图片，多细胞分析方法的好处是关注整个区域而不是单个细胞。因此，本方法可以快速评估图像内所有小胶质细胞的平均分枝（就终点和过程长度而言）。希望对大家有所帮助，祝大家早日发文章！ 参考文献： Young, K., Morrison, H. Quantifying Microglia Morphology from Photomicrographs of Immunohistochemistry Prepared Tissue Using ImageJ. J. Vis. Exp. (136), e57648, doi:10.3791/57648 (2018). |
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