研究蛋白与RNA互作的经典技术总结——RIP，还不赶快收藏？

基于免疫沉淀（Immunoprecipitation，IP）的技术是我们研究蛋白与其它大分子类分子互作的关键技术之一，比如研究蛋白与蛋白互作的Co-IP，蛋白与RNA互作的RIP，蛋白与DNA互作的ChIP，其基本原理就是通过要研究目的蛋白的抗体进行免疫共沉淀，接下来根据要检测的分子类型通过各种方法进行检测。

根据检测的目的，也可以分为寻找和确认两种。为了寻找哪些分子与目的蛋白结合，一般通过高通量组学的方法进行，比如芯片、测序和质谱等等，在所有鉴定到的分子中挑选可能的候选分子；为了验证哪些分子与目的蛋白结合，这时候因为已经有“怀疑”的分子了（比如文章已经报道过或者预测发现的），一般我们可以直接通过WB、qPCR等方法来检测。

以前我们已经介绍了DNA-RNA-蛋白互作的研究方法（文章篇）S3E5：一文掌握LncRNA—蛋白—DNA互作研究方法），今天我们就来单独拿出RIP（RNA Binding Protein Immunoprecipitation）实验来说一下这个技术的应用场景和技术细节。

需要注意的是：很多人常把RIP当作RNA pulldown，原因可能是RIP中的R（NA），实际上RNA Binding Protein Immunoprecipitation在缩写的时候直接把中间的Binding Protein省略了，所以如果缩写为RBPIP会更合适一些。

RIP 技术（RNA Binding ProteinImmunoprecipitation Assay，RNA 结合蛋白免疫沉淀）与ChIP实验很相似，主要侧重于蛋白质- RNA相互作用。主要是运用针对目标蛋白的抗体把相应的RNA-蛋白复合物沉淀下来，经过分离纯化就可以对结合在复合物上的RNA 进行q-PCR验证或者测序分析。

RIP 是研究细胞内RNA 与蛋白结合情况的技术，应用领域包括转录后调控研究、表观遗传调控。RNA结合蛋白 (RBP)参与mRNA的转录和成熟包括加工、转运、稳定、降解和翻译等生物过程；同样，一些mRNA分子在转录后水平受到核糖核蛋白复合体（RNP）的调节。

一、应用场景和数据解读

RIP技术是出现在很多高分文章中的常见和经典技术，不过，常见和经典不代表容易，要做好这个实验不仅对抗体等试剂、对操作人员的技术和经验也有一定要求。下面我们就来看看在研究不同类型RNA的时候所用到的RIP技术以及RIP的技术变种。

1. 研究lncRNA与蛋白互作

Long noncoding RNA MEG3 induces cholestatic liver injury by interaction withPTBP1 to facilitate shp mRNA decay.Hepatology 2017 02;65(2)

在这篇2017年发表的Hepagology文章中，lncRNA MEG3通过与蛋白PTPB1结合并促进shp mRNA的降解，并诱导胆汁淤积性肝损伤。

我们看一下这篇文章的描述：

Using RNA pull-down with biotin-labeled sense or anti-sense MEG3 RNA followed by mass spectrometry, we identified RNA binding protein polypyrimidine tract-binding protein 1 (PTBP1) as a MEG3 interaction protein and validated their interaction by RNA immunoprecipitation (RIP)。

即：先用RNA Pulldown 质谱来寻找与lncRNA MEG3结合的蛋白PTBP1，然后再用PTBP1的抗体通过RIP做验证。

下面我们来看RIP的图怎么来看：

这张图是检测RNA的电泳图。其中MEG3和PTBP1是我们要研究的分子，Hprt1是阴性对照。Input是未经IP的对照，IgG是用来判断非特异性扩增的对照，PART1是阳性对照（已知与MEG3结合的蛋白）。

这张图说明的是：

在MEG3的四条泳道中，PTBP1抗体IP后出现了类似阳性对照PARP1抗体IP后的条带(MEG3)，说明PTBP1与MEG3结合；而在IgG里面没有MEG3（很弱的背景），说明结合是特异性的。而Input因为是没有做富集的，有MEG3的条带。

2. 研究circRNA与蛋白互作

Foxo3 circular RNA retards cell cycle progression via forming ternary complexes with p21 and CDK2.Nucleic Acids Res. 2016 Apr 07;44(6)

在这篇2016年发表的Nucleic Acids Res文章中，circ-Foxo3通过与蛋白p21和CDK2结合调控细胞周期。

在这篇文章中，为了证明circ-Foxo3通过与蛋白p21和CDK2的结合，就用到了RIP实验。

We tested potential interactions of circ-Foxo3 with cell cycle associated proteins. Cell lysis prepared from NIH3T3 cells were subject to immuno-precipitation (IP) with anti-rabbit IgG, mouse IgG, cyclin A, cyclin B, cyclin C, cyclin D, cyclin E, CDK2, CDK4, CDK6, p16, p18, p21, p27 and p57 antibodies, followed by real-time PCR with primers specifc for the linear Foxo3 mRNA or circ-Foxo3. The experiment showed that circ-Foxo3 was pulled-down by immunoprecipitation experiments with antibodies against CDK2, CDK6, p16, p21and p27, which did not pull-down linear
Foxo3 mRNA.

文章中通过cyclin A等蛋白的抗体去做RIP，然后通过PCR来检测circ-Foxo3，所以结果的展示形式是柱状图：

二、实验流程

本文以模式生物黑腹果蝇S2细胞为研究对象，对RIP 技术（RNP免疫沉淀）进行优化。

材料与试剂准备

• 所有试剂均需用超纯水配制；

• 整个实验使用玻璃和塑料制品，不含DNase和RNase；

• 所有溶液通过0.2μm过滤器（微孔）过滤；

PBS	pH7.4，1.7 mM KH 2 PO 4 , 5.2 mM Na 2 HPO 4 , 150 mM NaCl
NT-2 buffer	50 mM Tris-HCl  (pH 7.4), 150 mM NaCl,1 mM MgCl 2 , 0.05% Nonidet P-40.
NET-2 buffer	0.5 M EDTA (30  μL), 0.1 M DTT (10 μL), RiboLock (4 μL),含有 PIC 的NT2 (850 μL)
全细胞裂解缓冲液	10 mM HEPES (pH 7.0), 100 mM KCl, 5mM MgCl  2 ,25 mM EDTA, 0.5% Nonidet P-40, 1% Triton X-100,0.1% SDS, 10% glycerol, 用时补加1 mM DTT, 80 U/mL of RNase inhibitor RiboLock, a cocktail of proteinase inhibitors,  PIC， 4 °C保存

 

操作过程：

  Gagliardi, M. and M.R. Matarazzo, Methods Mol Biol, 2016. 1480:p. 73-86.

（一）蛋白A琼脂糖凝胶抗体的固定：

1、取50μ L protein-A包被的磁珠悬浮液，先用PBS洗涤，然后用NT2缓冲液洗涤两次。

2、将NT2缓冲液（5-10倍体积的protein-A包被的磁珠悬浮液）和BSA（1mg）添加到protein-A包被的磁珠悬浮液中，在室温下搅拌培养2小时（阻塞阶段），可以减少mRNA与protein-A/G包被的磁珠的非特异性相互作用。

3、将抗体（5 -20g）添加到混合物中，然后在室温下孵育1小时。

4、用1ml的NT2缓冲液洗涤protein-A包被的磁珠，然后在搅拌下孵育3min，1000g，离心1min，重复此过程5次，总共洗6次。洗涤不充分可能导致抗体与protein-A/G包被的磁珠的非特异性结合增加。

（二）细胞提取物的制备

1、将细胞先转移到离心管，放在冰盒中（每个RIP样品至少需要25x106个细胞）；

2、将细胞在4℃，1000g条件下离心10min；

3、细胞用冷PBS洗涤两次；

4、移走PBS，用与细胞等体积的RIP裂解液重悬细胞，轻轻地吹打均匀（约20次）后于冰上静置5min；

5、将细胞放在液氮中，然后在冰上融化，此过程可促进细胞裂解；

6、每管分装200ul-400 ul细胞裂解液，贮存于-80℃冰箱中；

（三）免疫沉淀反应

1、将存放在-80°C的细胞裂解物4 °C，14000 g，离心10 min；

2、上清液转移到一个新的管子中，相同条件下离心5 min，将上清液再转移到另一个新的管子中；

3、在制备的上清液中加入10倍体积的NET-2buffer重悬的磁珠，混匀；

4、取出十分之一的样品作为“Input”备份，−80 °C保存备用；

5、在裂解液中加入10倍体积的NET-2 buffer重悬的磁珠，作为阴性对照；

6、接着在4℃恒温搅拌下孵育12-16h；

7、孵育后，离心分离protein-A包被的磁珠，取出十分之一的上清作为“output”备份；

8、用NT2缓冲液洗涤磁珠，将其重悬后并混合3min，然后4℃，1000 g离心，重复此过程3-6次，洗涤次数取决于抗体，即，对于低亲和力的抗体不超过3次洗涤，对于高亲和力的抗体至少6次洗涤；

（四）RNA的分离与分析

1、将TRIZOL（200 L）加入到等体积的磁珠中，并将混合物重新悬浮，RNA立即被分离或冷冻在液氮中；最好在分离RNA后立即合成cDNA，因为冷冻和解冻步骤增加了mRNA降解的风险。

2、琼脂糖凝胶电泳检测RNA质量，有必要确认与核糖体RNA相对应的条带的存在。与大多数昆虫一样，果蝇大核糖体亚基的rRNA在变性条件下加工，并根据DNA标记物与小核糖体亚基的rRNA一起在2000bp水平上迁移。在RNA降解的情况下，将观察到大量短片段。不推荐使用有50%的降解程度的RNA做后续研究；

3、分光光度法测定RNA浓度，并对其纯度进行了评价，在免疫沉淀中使用优质抗体的情况下，可以从25x106个S2细胞中获得50-500 ng的RNA。

4、合成cDNA，并用PCR－RT法测定所需转录本的水平，在一个PCR-RT反应中，需要2.5-5 ng的cDNA；

三、常见问题解析

1、低效免疫沉淀

当使用兔多克隆抗体时，我们建议使用protein-A包被的磁珠；在使用小鼠单克隆抗体的情况下，最好使用protein-G琼脂糖；如果样品中的RNA不被降解，则细胞裂解物与抗体的孵育时间延长会增加复合物的有效沉淀。

2、高水平非特异性RNA的结合

不含抗体的非免疫血清或纯protein-A琼脂糖凝胶应作为控制RNA水平的背景。为了降低背景水平，建议使用更严格的洗涤条件。例如，可以将尿素(0.5-3M)、SDS(最多0.1%)、脱氧胆酸钠等添加到NT2和裂解缓冲液中。EDTA在免疫沉淀缓冲液中的引入降低了噪声水平，还可导致核糖体和核糖体结合的RNPs的解离，从而增强抗原、抗体相互作用的特异性。

3、从RIP中分离出少量RNA

必须确保细胞中有足够水平的所需蛋白质。用蛋白质印迹法测定沉淀蛋白的量，如果未检测到蛋白质，则存在沉淀抗体表位不可及的可能性。在这种情况下，RNA结合蛋白的沉淀可以使用表位标签的RBP进行。同时还要防止RNA蛋白复合物的降解，应在所有阶段添加核糖核酸酶和蛋白酶抑制剂。

RIP的许多方案在缓冲液组成、制备细胞提取物的方法及提取物与抗体孵育的持续时间上有所不同，这些参数取决于所研究的对象；该抗体的特性；细胞中的蛋白质的定位；RNA分析和选择方法等。故本实验方法仅作为一个参考，特定实验的最佳条件通常只能凭多次预实验获得。

参考文献：

• Gagliardi, M. and M.R. Matarazzo, RIP: RNAImmunoprecipitation. Methods Mol Biol,2016. 1480: p. 73-86.

• Z. M. Kachaev*, R. A.Gilmutdinov, D. V. Kopytova, A. et.al, RNA Immunoprecipitation Technique forDrosophila melanogaster S2 Cells, Molecular Biology, 2017, Vol. 51, No. 1, pp.72–79.