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撰文丨张先荣 （南方医科大学南方医院） 点评丨秦 聆 （宾夕法尼亚大学） 罗 剑 （华东师范大学） MicroRNAs (miRNAs) 是一类进化上较保守的非编码小分子RNAs，大约22个核苷酸，由前体转录本通过剪切加工而成。miRNA片断上的种子区域（seed region，一般为miRNA的 2-7位碱基）与mRNA上的靶序列严格互补配对，通过靶向抑制mRNA翻译或降解mRNA而调节基因表达。miRNA的表达和功能具有组织和细胞特异性，调节多种生理和病理过程。在肿瘤、代谢性疾病和感染性疾病的临床前开发和临床试验研究中，miRNAs作为治疗靶标或诊断生物标志物已取得突破性进展，具有良好应用前景。但是，调节骨代谢疾病的关键miRNAs尚有待深入研究。 不久前，纽约特种外科医院（Hospital for Special Surgery）、威尔康乃尔医学院（Weill Cornell Medical College）赵宝红课题组在Nat Commun在线发表了题为Bone protection by inhibition of microRNA-182的研究论文。该研究最新发现，无论是在生理性骨代谢过程中，还是在骨质疏松症（osteoporosis）或风湿性骨关节炎（rheumatoid arthritis, RA）等病理情况下，miR-182是正向调控破骨细胞分化的关键因子。该研究证明双链RNA依赖的蛋白激酶（protein kinase double-stranded RNA-dependent，PKR）是miR-182调控破骨细胞分化的新靶标。miR-182通过抑制PKR表达而下调内源性干扰素-γ （interferon-β，IFN-β）的自分泌反馈环路，从而促进破骨细胞分化。 赵宝红课题组长期从事miR-182调控破骨细胞分化的分子机制研究。继2016年发表于J Immunol的关于转录因子RBP-J通过调节miR-182促进TNF-α所诱导的破骨细胞分化的工作后【1】，此次研究进一步揭示了miR-182在绝经性骨质疏松症和RA发生中的作用和机制。首先，课题组采用原代破骨细胞前体即骨髓来源巨噬细胞（bone marrow-derived macrophages，BMMs），以核因子κB受体激活因子配体（receptor activator of nuclear factor kappa-B ligand，RANKL）诱导其破骨细胞成熟分化，发现miR-182在诱导后48小时和72小时呈显著高表达。进而分别通过破骨前体细胞特异性敲除Mir182的小鼠（Mir182△M/△M）（图1）和Mir182转基因小鼠（Mir182mTg），采用TRAP染色、破骨细胞分化关键转录因子和标志基因表达检测、骨微结构分析等实验，证明miR-182是促进破骨细胞分化的正向调控子，参与调控骨代谢平衡。 图1：miR-182促进破骨细胞分化，调节骨代谢 为明确miR-182在病理性骨量丢失中的作用，课题组通过Mir182△M/△M敲除小鼠和Mir182mTg过表达小鼠，采用卵巢切除（ovariectomy, OVX）所诱导的绝经性骨质疏松症模型、脂多糖（lipopolysaccharides，LPS）诱导的炎症性骨量丢失模型、kBxN血清所诱导的关节炎模型（图2），研究骨表型改变。结果表明，Mir182△M/△M小鼠对OVX、LPS、kBxN血清所诱导的破骨细胞分化和骨量丢失具有明显耐受性。反之，TNF-α处理可进一步激活Mir182mTg小鼠的破骨细胞分化，促进骨溶解。课题组还采用纳米壳聚糖（chitosan, CH）作为载体，包装miR-182抑制子寡核苷酸，通过尾静脉注射用药，验证了靶向抑制miR-182对于改善OVX或炎症所致病理性骨量丢失的治疗价值。 图2：miR-182缺失可改善病理性破骨细胞分化和骨丢失 miR-182如何调控破骨细胞分化？课题组分离野生型及Mir182△M/△M小鼠破骨前体细胞，采用高通量分析比较，证明miR-182缺失可显著阻断RANKL诱导的破骨细胞分化调节基因和标志基因的表达。应用Gene Ontology分析发现，miR-182缺失可上调防御反应基因的表达，特别是干扰素-β（interferon-β，IFN-β）。基因富集分（gene set enrichment analysis，GSEA）也显示，在RANKL诱导下，Mir182△M/△M细胞最显著富集的基因集为I型干扰素（type I interferons，IFN）基因（图3）。由于内源性IFN-β是RANKL诱导破骨细胞分化过程中的一个重要的负反馈调节环节【2, 3】，Mir182△M/△M细胞所表现的IFN反应基因的富集效应可能为miR-182缺失进一步放大了RANKL所诱导的IFN通路反应所致。 图3: miR-182通过靶向PKR调节内源性IFN-β 为明确miR-182调控破骨细胞分化的靶标基因，课题组分离野生型与miR-182功能缺失型（Mir182△M/△M），野生型与miR-182功能获得型（Mir182mTg）两组小鼠BMMs，应用RNA组学测序和差异表达分析，并与其他已发表数据库结果【4】比较，证明miR-182的潜在靶标基因为编码PKR的Eif2ak2基因。进一步应用荧光素酶报告基因分析，明确了miR-182结合Eif2ak2基因3’UTR的种子区域。由于PKR在I型IFN通路中发挥关键作用，可激活IFN-β表达【5, 6】。课题组深入研究采用PKR敲除小鼠和Mir182△M/△M小鼠，分别联合IFN-β中和抗体，阐释了miR-182直接靶向下调PKR表达，进而抑制RANKL所诱导的内源性IFN-β表达，从而下调破骨细胞分化过程中的抑制性环路功能，激活破骨细胞分化（图4）。 图4： miR-182靶标PKR通过调节IFN-β反馈环路抑制破骨细胞生成 该论文最后应用临床RA患者标本，证明miR-182-PKR-IFN-β调节轴还与RA发生具有高度相关性。与健康对照相比，RA患者CD14(+) 外周血单核细胞（peripheral blood mononuclear cells, PBMCs）的miR-182呈显著高表达，而PKR和IFN-β水平明显降低。采用临床RA治疗最成功的TNF阻断疗法发现，TNF阻断治疗可显著降低患者CD14(+) PBMCs细胞的miR-182表达，并上调PKR和IFN-β表达，且显著抑制其破骨细胞分化。 本研究由赵宝红教授指导第一作者Kazuki Inoue博士和其他研究室成员完成。赵宝红教授是文章的独立通讯作者。 专家点评 秦聆（宾夕法尼亚大学） 骨重建的稳态依赖于破骨细胞的骨吸收功能和成骨细胞的骨形成功能。破骨细胞是骨组织中唯一具有骨吸收功能的细胞，由髓系造血前体细胞（hematopoietic myeloid precursors）在RANKL作用下分化成熟并被激活。破骨细胞的过度激活在多种骨破坏性疾病如RA和妇女绝经后骨质疏松症中发挥至关重要的作用。该研究首次系统阐释了miR-182-PKR-IFN-β调节轴在RANKL所诱导的破骨细胞分化中的调节作用机制，以及骨代谢和骨溶解性疾病发生中的作用。miR-182在动物实验和RA患者的系统研究数据提供了其成为绝经性骨量丢失和炎症性骨溶解新靶点的证据，同时也为基于干预miR-182开发新型抗骨溶解药物提供了理论和实验基础。 罗剑 （华东师范大学） 破骨细胞的过度活化与骨质疏松和关节炎等人类疾病密切相关，而系统研究microRNA参与调控破骨细胞活化还鲜有报道。美国纽约特种外科医院（康奈尔大学医学院附属医院，全美骨科排名第一医院）的赵宝红教授实验室系统研究了microRNA-182在破骨细胞中的调控作用，发现它能通过靶向PKR从而调控IFNb信号通路，进而调控破骨细胞的生理和病理活化。本项研究至少有四点重要意义：第一，该研究利用大量小鼠体内遗传学手段（破骨细胞特异敲除和破骨细胞特异过表达）和药理学手段（microRNA抑制剂），利用多种疾病动物模型（卵巢切除模型和炎症因子诱导模型），充分无疑的证明了miR-182对体内、体外破骨细胞的生理和病理活化具有至关重要的调控作用。第二，最出彩的是本项研究的临床和转化研究，作者发现miR-182-PKR-IFNb信号轴的表达与类风湿关节炎中破骨细胞活化密切相关，并且miR-182抑制剂在动物模型中对破骨细胞相关疾病如骨质疏松和关节炎等具有惊人的防治效果，值得一提的是，作者通过FDA批准的几丁质纳米颗粒包裹，更能提高miR-182抑制剂的效果，为该项研究的转化提供了很大的想象空间。第三，本研究发现了一个新的破骨细胞调控通路miR-182-PKR-IFNb，为人们理解IFNb在破骨细胞中的重要作用提供依据。第四，本项研究是继2014年德州医学中心万谊虹教授实验室发现miR-34a参与调控破骨细胞生理和病理活化（Nature 2014 512:431-5.）后的又一重要发现，但是这两篇研究各有侧重，万谊虹教授发现miR-34a能抑制破骨细胞活化，因此利用miR-34a本身能治疗破骨细胞相关疾病包括骨质疏松和肿瘤骨转移。而本项研究发现miR-182促进破骨细胞活化，因此需要抑制miR-182来治疗破骨细胞相关疾病，且本项研究更侧重从临床疾病中发现miR-182具有重要作用。总的来说，该项研究堪称破骨细胞研究的范本，逻辑流畅，方法恰当，分析合理，一气呵成。 参考文献 1. Miller, C. H. et al. RBP-J-regulated miR-182 promotes TNF-alpha-induced osteoclastogenesis. J. Immunol. 196, 4977–4986 (2016). 2. Takayanagi, H. et al. RANKL maintains bone homeostasis through c-Fos-dependent induction of interferon-beta. Nature. 416, 744–749 (2002). 3. Zhao, B. & Ivashkiv, L. B. Negative regulation of osteoclastogenesis and bone resorption by cytokines and transcriptional repressors. Arthritis Res. Ther. 13, 234 (2011). 4. Krishnan, K. et al. MicroRNA-182-5p targets a network of genes involved in DNA repair. RNA. 19, 230–242 (2013). 5. Haller, O., Kochs, G. & Weber, F. The interferon-response circuit: induction and suppression by pathogenic viruses. Virology 344, 119–130 (2006). 6. Munir, M. & Berg, M. The multiple faces of protein kinase R in antiviral defense. Virulence 4, 85–89 (2013). |
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