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1. 有的文献同时做了Native RIP和Formaldehyde-cross-linked RIP，目的是什么呢，这两种方法在检测RNA和蛋白相互作用方面有什么不同吗？看到园子里有人说多聚甲醛固定是避免RNA与蛋白在细胞裂解后继续作用而结合，是这样吗，但是很多文献又都没有细胞固定这一步骤。 两个方法各有特点。固定了再做rip的时候更有效，但是蛋白RNA相互作用力是有强有弱的，固定的时候可能会把一些弱相互作用也拉出来。不固定可以尽可能保持这种强弱差别。我们一直是不固定的。 2. RIP实验中珠子与抗体结合前需要封闭吗，为什么呢？ 封闭是为了减少非特异，Millipore的方法有BSA固定步骤，个人觉得这一步很容易加入RNA酶污染。 3. 有一步骤是pre-clear,它是在抗体固定在agarose beads之前还是之后，因为看到的protocol有矛盾。 在之前，用同型IgG把与IgG非特异结合的蛋白RNA去除一部分。 4. RNA提取中，加入糖原以显示RNA沉淀，糖原会影响后续的实验吗，比如RT-PCR, RNA 测序。 糖原主要是RNA量少的时候帮助沉淀用的，对后续实验影响不大，测序和RTPCR做过，肯定没问题。 5. 如果我是裂解过表达蛋白X的293T细胞，进行RIP,那得到的RNA与lncRNA的相互作用对其他细胞或者组织也适用吗？ 这个不完全适用，首先过表达的实验都有一定的假阳性风险。另外不同细胞组织表达的基因不一样。RNA的空间构象是需要其他蛋白质和RNA一起完成的。 |
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