【基础研究】缺血缺氧条件下丁苯酞促进人脐静脉内皮细胞形成血管的体外实验及机制研究

文章来源：中华神经科杂志, 2018,51(6) : 464-469

作者：杨毅 官俏兵 郭丽 张晓玲 韩晨阳 

摘要

目的

探索体外缺血缺氧条件下丁苯酞促进人脐静脉内皮细胞(HUVEC)形成血管及其与血管内皮生长因子/血管内皮生长因子受体2(VEGF/VEGFR2)－Notch1/Dll4信号的相关性。

方法

对HUVEC传代培养后设置对照组、模型组、丁苯酞干预组(高剂量组和低剂量组)，调整细胞浓度为1×10⁵个/ml，每组从均匀的细胞悬液中直接加入1 ml(即每组细胞1×10⁵个)，模型组和丁苯酞干预组均为缺血缺氧条件下培养的HUVEC，丁苯酞高、低剂量组使用含有终浓度分别为20 μmol/L和5 μmol/L的丁苯酞培养基进行培养。采用细胞增殖活性检测法检测各组细胞的细胞活力，细胞划痕实验检测各组细胞的迁移能力，体外血管形成实验检测各组细胞的成管能力，蛋白质印迹法检测受体蛋白VEGFR2、Notch1和配体Dll4的表达水平，ELISA法检测培养基中VEGF的表达水平，实时荧光定量PCR检测VEGF、VEGFR2、Notch1、Dll4的mRNA表达水平。

结果

丁苯酞可以提高缺血缺氧条件下HUVEC的存活率，低剂量组和高剂量组在培养6、12、24、48 h过程中，细胞存活率为78.6%±3.0%、59.6%±5.3%、44.6%±4.2%、38.2%±4.3%和88.6%±6.3%、67.5%±5.4%、53.3%±4.2%、46.3%±3.9%，与模型组比较差异均有统计学意义(75.2%±5.8%、53.2%±4.8%、36.2%±7.8%，22.5%±4.1%；t＝4.513、6.231、9.322、9.674，P＝0.021、0.018、0.026、0.015；t＝8.123、11.211、12.312、14.154，P＝0.001、0.002、0.001、0.001)。细胞迁移实验中丁苯酞低剂量组和高剂量组的细胞迁移能力分别为52.3%±4.2%和87.5%±5.2%，较模型组(18.5%±3.2%)及对照组(22.3%±4.1%)均明显升高(t＝18.324、15.183，P＝0.000、0.000；t＝22.142、19.341，P＝0.000、0.000)。蛋白检测中，丁苯酞低剂量组和高剂量组VEGFR2、Notch1以及Dll4的相对表达量为1.12±0.17、0.35±0.07、0.42±0.08和1.30±0.15、0.41±0.10、0.48±0.11，相比模型组(0.82±0.05、0.30±0.03、0.32±0.04)明显升高(t＝6.120、2.123、4.112，P＝0.000、0.020、0.003; t＝8.122、3.851、5.130，P＝0.000、0.000、0.001)。丁苯酞低剂量组和高剂量组中VEGF、VEGFR2、Notch1和Dll4的mRNA表达水平分别为0.43±0.08、0.41±0.05、0.38±0.03、0.36±0.04和0.58±0.05、0.50±0.06、0.41±0.05、0.52±0.06，相比模型组(0.28±0.03、0.34±0.04、0.27±0.03、0.19±0.04)差异均具有统计学意义(t＝3.122、3.825、4.311、5.211，P＝0.000、0.006、0.001、0.000；t＝4.225、4.872、5.311、8.220，P＝0.000、0.000、0.000、0.000)。

结论

丁苯酞可以在体外缺血缺氧条件下促进HUVEC形成血管，其机制可能与VEGF/VEGFR2－Notch1/Dll4信号的激活有关，这可能是丁苯酞改善急性缺血性卒中脑微循环的机制之一。

缺血性脑卒中是一种急性脑缺血缺氧性疾病，在短时间造成脑组织中血管闭塞，神经细胞大量死亡，且预后较差，致死致残率较高^[1]。目前临床工作中对于急性缺血性卒中的治疗主要有急性期的溶栓治疗和保守的药物治疗。丁苯酞是从芹菜中提取的一种单体药物，基础实验证明丁苯酞可以有效抑制急性缺血性卒中脑损伤的多个病理环节，在缺血性脑病中有着广泛的应用。近年来的研究发现，丁苯酞还可以缩小梗死的病灶，其作用和微循环的改善有关^[2,3]，对于脑卒中患者而言，侧支血管的形成与开通无疑是有利于预后的。因此，我们通过体外实验了解丁苯酞对缺血缺氧诱导人脐静脉内皮细胞(human umbilical vein endothelial cells，HUVEC)形成血管的影响，并探索其机制。

材料和方法

一、细胞和试剂

丁苯酞标准品购于中国食品药品检定研究院(批号：101035，纯度99%)，HUVEC购于武汉普诺赛生物科技有限公司(批号：CL0122)，F12K完全培养基与无血清培养基购于武汉普诺赛生物科技有限公司(批号：PM150910、PM150910B)，细胞增殖活性检测(CCK－8)试剂盒购于武汉博士德生物技术有限公司(批号：AR1160),血管内皮生长因子(VEGF)的ELISA试剂盒购于武汉博士德生物技术有限公司(批号：EK0539)，Matrigel基质胶购于美国BD公司(批号：356234)，血管内皮生长因子受体2(VEGFR2)、Notch1、Dll4的一抗和辣根过氧化物酶标记二抗购于美国Abcam公司(批号：5473、65297、7280)，二喹啉甲酸(BCA)蛋白定量试剂盒购于博士德生物技术有限公司(批号：0146)，cDNA试剂盒购于江苏凯基生物技术有限公司(批号：KGA1311)，实时定量PCR试剂盒/SYBR Green Realtime PCR Master Mix购于中国欣百诺生物科技有限公司(批号：E090)。总RNA提取试剂盒(TRIzol法)购于中国北京百泰克(BioTeKe)公司(批号：RP2041)。

二、细胞模型的构建及分组

使用F12K完全培养基(含10%胎牛血清)培养HUVEC，待细胞长至80%左右进行消化。将细胞分为对照组、模型组和丁苯酞干预组(高剂量组、低剂量组)，调整细胞浓度为1×10⁵个/ml，每组从均匀的细胞悬液中直接加入1 ml。对照组使用F12K完全培养基对细胞进行常规培养，模型组和丁苯酞干预组的3组细胞使用无血清的F12K置于缺氧罐中，罐中气体使用氮气置换后于培养箱中培养，高剂量丁苯酞干预组使用20 μmol/L终浓度的丁苯酞干预，低剂量组使用5 μmol/L终浓度的丁苯酞干预。

三、检测指标

1．CCK－8法检测各组细胞活力：

在培养后6、12、24、48h 4个时间点分别检测各组细胞的活力，选择适合的时间点进行接下来的实验。

2．细胞划痕实验检测HUVEC的迁移能力：

细胞的迁移率采用百分率表示，计算公式为：迁移率(%)＝(S1－S2)/S1×100%，其中S1为实验前的镜下划痕面积，S2为迁移后的镜下划痕面积，采用Image J软件进行测定。

3．检测HUVEC体外形成血管的能力：

Matrigel基质胶为细胞成管的培养基质，检测HUVEC体外形成血管的能力。

4．ELISA法检测培养基中VEGF的表达水平：

收集细胞后，3 000 r/min下离心15 min，收集培养基后使用BCA试剂盒进行蛋白定量，调整每组培养基的蛋白量后参照ELISA试剂盒说明操作。

5．蛋白质印迹法检测受体蛋白VEGFR2、Notch1、Dll4的表达水平：

目的蛋白的表达以吸光度值与内参蛋白磷酸甘油醛脱氢酶的吸光度值比值表示。

6．实时荧光定量PCR检测VEGF、VEGFR2、Notch1、Dll4的mRNA表达水平：

直接通过CT值比较转录水平的表达，计算方法为：ΔCT＝样本CT值－内参CT值，－ΔΔCT＝对照标本ΔCT－目的标本ΔCT(对照标本ΔCT为正常组的ΔCT平均值)，最终结果以2^－ΔΔCT表示。

四、统计学方法

采用SPSS 17.0统计学软件对数据进行统计学处理。符合正态分布的实验数据以均数±标准差(±s)表示，组间比较采用独立样本t检验。P<>

结果

一、HUVEC活力

缺血缺氧条件下会导致HUVEC的凋亡，随着培养时间延长，HUVEC的存活率下降。在48 h模型组的细胞存活率仅为22.5%±4.1%，而经丁苯酞干预后细胞的存活率显著升高：低剂量组在培养6、12、24、48 h过程中，细胞存活率为78.6%±3.0%、59.6%±5.3%、44.6%±4.2%、38.2%±4.3%，与模型组(75.2%±5.8%、53.2%±4.8%、36.2%±7.8%，22.5%±4.1%)比较差异均有统计学意义(t＝4.513、6.231、9.322、9.674，P＝0.021、0.018、0.026、0.015)；而高剂量组在培养6、12、24、48 h过程中，细胞存活率为88.6%±6.3%、67.5%±5.4%、53.3%±4.2%、46.3%±3.9%，与模型组比较差异也均有统计学意义(t＝8.123、11.211、12.312、14.154，P＝0.001、0.002、0.001、0.001)。但在培养后24 h和48 h时，模型组以及丁苯酞组的细胞存活率均低于50%，培养12 h时3组细胞的活力较好，所以选择干预12 h为较优的实验时间。各组细胞的存活率详见图1。

图1 各组人脐静脉内皮细胞(HUVEC)的存活率结果。^a同一时间点与对照组比较，P<>^b同一时间点与模型组比较，P<>

二、HUVEC迁移能力(图2)

图2 人脐静脉内皮细胞迁移能力光镜图　×400。A：对照组；B：模型组；C：低剂量丁苯酞干预组；D：高剂量丁苯酞干预组

以培养12 h为时间点，在缺血缺氧条件下，模型组HUVEC迁移能力为22.3%±2.1%，和对照组细胞的迁移能力(21.8%±3.1%)差异无统计学意义。而经丁苯酞干预后HUVEC的迁移能力显著提高，低剂量组细胞迁移能力为52.3%±4.2%，较模型组(18.5%±3.2%)及对照组(22.3%±4.1%)差异均具有统计学意义(t＝18.324、15.183，P＝0.000、0.000)，而高剂量组的迁移能力为87.5%±5.2%，相比模型组和对照组差异也具有统计学意义(t＝22.142、19.341，P＝0.000、0.000)。

三、HUVEC体外血管的形成能力

以培养12 h为时间点，镜下观察对照组和模型组细胞未见血管形成，但是有成管趋势，而缺血缺氧的培养条件可以促进HUVEC形成管腔，但是作用微弱，而高剂量丁苯酞干预组明显可见管腔的形成，血管形成能力显著优于低剂量组和模型组，说明丁苯酞可以在缺血缺氧环境中促进HUVEC形成血管。详见图3。

图3 各组人脐静脉内皮细胞体外管腔形成的镜下图　×400。A：对照组；B：模型组；C：低剂量丁苯酞干预组；D：高剂量丁苯酞干预组

四、VEGF表达水平

缺血缺氧条件下模型组的VEGF的表达水平为(952.3±18.5)pg/ml，显著高于对照组[(421.5±14.6)pg/ml, t＝29.315，P＝0.000]，说明缺血缺氧环境可以诱导VEGF的产生。而经丁苯酞干预后，VEGF的表达水平显著上调，低剂量组和高剂量组的表达水平分别为(1 350.2±21.2) pg/ml、(1 680.5±18.97)pg/ml，相比模型组差异均具有统计学意义(t＝12.336、16.210，P＝0.000、0.000)。

五、VEGFR2、Notch1及Dll4配体的表达结果

在缺血缺氧条件下，药物组中VEGF/VEGF2－Notch1/Dll4信号的表达相比对照组显著增高，低剂量组中VEGFR2、Notch1以及Dll4的相对表达量为1.12±0.17、0.35±0.07、0.42±0.08，相比模型组(0.82±0.05、0.30±0.03、0.32±0.04)差异具有统计学意义(t＝6.120、2.123、4.112，P＝0.000、0.020、0.003)。高剂量组中VEGFR2、Notch1以及Dll4的相对表达量为1.30±0.15、0.41±0.10、0.48±0.11，相比模型组差异也具有统计学意义(t＝8.122、3.851、5.130，P＝0.000、0.000、0.001)。提示缺血缺氧可以诱导该信号通路的激活。具体结果详见图4。

VEGF：血管内皮生长因子；VEGFR2：血管内皮生长因子受体2；GAPDH：磷酸甘油醛脱氢酶；图5同

图4 缺血缺氧条件下丁苯酞对于VEGF/VEGFR2－Notch1/Dll4信号表达的影响

六、VEGF、VEGFR2、Notch1和Dll4的mRNA表达结果

4种蛋白的基因引物设计结果详见表1。缺血缺氧条件下低剂量组中VEGF、VEGFR2、Notch1和Dll4的mRNA表达水平分别为0.43±0.08、0.41±0.05、0.38±0.03、0.36±0.04，相比模型组(0.28±0.03、0.34±0.04、0.27±0.03、0.19±0.04)差异具有统计学意义(t＝3.122、3.825、4.311、5.211，P＝0.000、0.006、0.001、0.000)。而高剂量组中VEGF、VEGFR2、Notch1和Dll4的mRNA表达水平分别为0.58±0.05、0.50±0.06、0.41±0.05、0.52±0.06，相比模型组差异也具有统计学意义(t＝4.225、4.872、5.311、8.220，P＝0.000、0.000、0.000、0.000)。具体详见图5。

图5 VEGF、VEGFR2、Notch1和Dll4的mRNA表达水平。^a与对照组比较，P<>^b与模型组比较，P<>

讨论

丁苯酞是从芹菜中提取的一种有效成分，可以分为左旋体和右旋体，临床常用消旋体^[4]，研究发现丁苯酞具有保护神经细胞、增加脑缺血区血流量、改善脑缺血组织的微循环和全脑缺血后的能量代谢、抑制炎性反应等作用^[5]。同时可以抗惊厥、抗癫痫，涉及脑缺血病理的多个环节和靶点^[6]。在改善脑微循环的研究中^[7,8]，研究者提出脑微循环的障碍可以造成脑血流量降低，继发脑能量代谢失调，导致脑组织坏死、神经功能缺损及炎性反应的发生。相关研究还表明，丁苯酞预防及治疗性给药可以增加小鼠模型大脑中动脉阻断后脑微动脉管径和血流速度，改善软脑膜的微循环^[9]。临床研究结果提示丁苯酞可以促进侧支循环的建立，起到改善微循环的作用，减少梗死后的出血现象^[7]。

侧支循环的开放有赖于侧支血管的形成与开通，而血管形成是一个极其复杂的过程。VEGF是目前公认的在血管再生的全程中发挥作用的一种生长因子，最早在1983年被Dvorak等^[10]提出，共由8个外显子和7个内含子组成，VEGF主要是通过激动VEGFR而发挥作用。VEGFR包括3种亚型，分别是VEGFR1、VEGFR2和VEGFR3，它们均属于酪氨酸激酶受体家族，在细胞膜外大约有750个氨基酸残基^[11]。在血管新生的过程中，VEGF与VEGFR2结合后激活下游信号，促进血管内皮细胞上的整合素与配体分离，在局部血管基底膜分解后，内皮细胞可以在局部增殖并向外迁移^[12]，此时VEGF可以介导Notch1/Dll4信号促进内皮细胞分化为顶端细胞逐渐形成血管芽^[13]，顶端细胞在VEGF的作用下产生伪足结构，有利于迁移、黏附及微血管网络的生成。可以说，VEGF/VEGFR2－Notch1/Dll4在血管的新生过程中扮演着十分重要的角色，一般的血管新生都需要通过该通路。

我们以HUVEC作为研究对象，在模拟缺血缺氧的环境下，着重研究了丁苯酞对于HUVEC的体外血管生成的促进作用和相关机制。结果表明，在缺血缺氧条件下，丁苯酞可以提高HUVEC的存活率，促进其迁移，诱导其体外血管形成。而这种促进血管生成的作用与VEGF/VEGFR2－Notch1/Dll4通路的激活有关。丁苯酞在缺血缺氧条件下可以促进该信号通路中关键细胞因子VEGF的表达，促进其受体VEGFR2和Notch1以及Dll4配体的表达水平。

综上所述，丁苯酞可以促进HUVEC在缺血缺氧条件下生成血管，其作用机制与VEGF/VEGFR2－Notch1信号通路的激活有关，这可能是丁苯酞在急性缺血性卒中后促进侧支血管形成和改善微循环的机制之一。

参考文献略