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癌症精准疗法的开发需要鉴定癌症的驱动基因。人类肿瘤测序有助于发现潜在的癌基因或抑癌基因，而强大的动物模型有助于发现驱动癌症恶性转化的候选基因。新的癌基因的发现和癌症精准治疗的开发通常会受相关模型生成速度的限制。在黑色素瘤中，某些遗传亚型，包括“三重野生型”肿瘤（即BRAF，NRAS和NF1的野生型）缺乏可靠的模型。通过定期的转基因和育种开发新的动物模型是耗时耗力的，需要新颖有效的建模方法来研究体内癌症基因。 粘膜黑色素瘤（mucosalmelanoma）是一种罕见但致命的黑色素瘤形式，发生在防晒组织中。针对驱动这些肿瘤生长的遗传变化，人们知之甚少。 为了更好地了解粘膜黑色素瘤并确定其致癌基因和治疗策略，Ablain等人从来自43名患者的原发性或转移性粘膜黑色素瘤中提取DNA，进行靶向测序（平均覆盖率中位数为300倍），通过测量，粘膜黑色素瘤的基因组不稳定性是癌症中最高的之一。对于每个病例，确定了已知在癌症中致病的点突变，扩增和缺失（图1A）。BRAF（16％），RAS同种型（16％）或NF1（14％）的变化在86％的粘膜黑色素瘤中被发现。并且通过GISTIC2分析确定了在样本中反复扩增和缺失的基因组区域，揭示了染色体带15q14是经常缺失的区域，发生在21％的病例中（图1C）。15q14的所有缺失都包括SPRED1基因座，并且在三种情况下，SPRED1是缺失区域内唯一的基因。
图1
为了证实SPRED1双等位基因失活的肿瘤中SPRED1蛋白表达的丧失，作者对SPRED1进行了免疫组织化学检测（26例，8例双等位基因缺失，2例单等位基因缺失，16例未发现SPRED1缺失的证据）。结果有37％显示SPRED1功能丧失（通过免疫组织化学的双等位基因失活和/或SPRED1蛋白的缺失）。 接着分析了SPRED1在黑色素瘤中失活的遗传背景。大多数SPRED1缺失的病例是“三重野生型”（即，野生型BRAF,NRAS 以及NF1)）。30％的SPRED1缺失病例（23例中有7例）也同时存在KIT突变（P= 7.8×10-6）（图2C）。另有5例SPRED1缺失伴有BRAF或NRAS损伤改变，3例PTEN深度缺失，表明SPRED1失活可能与激活MAPK或磷酸肌醇3-激酶（PI3K）途径的其他致癌事件相关。 图2
为了评估SPRED1在体内黑色素瘤中的作用，作者创建了MAZERATI（Modelingapproach in Zebrafish for Rapid Tumor Initiation，利用斑马鱼模拟快速肿瘤起始方法），是一个快速模拟体内潜在癌症驱动因子的平台。双载体MAZERATI系统能够在3个月内在F0成体动物中有效且快速地产生遗传定义的原发性肿瘤，并且可用于测试癌基因和抑癌基因的多种组合对肿瘤发生的影响，能够模拟多种遗传背景，包括SPRED1在黑色素瘤中的缺失。（图3，B至E）。 为了确定SPRED1在不同背景下的缺失的影响，作者使用CRISPRMini -CoopR载体在各种斑马鱼黑色素瘤模型中灭活SPRED1，该载体在黑色素细胞特异性mitfa启动子的控制下表达Cas9，并含有mitfa小基因，其在注射到mitfa-/-胚胎中时黑色素细胞形成（图3A）。-CoopR载体表达致癌基因KITK642E，BRAF V600E或NRASQ61R，以及CRISPR MiniCoopR载体，靶向抑癌因子TP53，PETN或cdkn2a。除了表达NRASQ61R的载体外，这些载体中没有一个单独在成年Casper斑马鱼中引发癌症，说明需要癌基因表达和抑制基因失活才能触发黑色素瘤形成（图3，B至E））。SPRED1与TP53组合的靶向在注射后一年内未导致黑色素瘤形成（图3E），表明SPRED1缺失是比KIT，BRAF或NRAS突变更弱的驱动因子。靶向SPRED1与KITK642E或BRAF V600E组合也未能引发黑色素瘤，表明SPRED1缺失不能替代tp53或CDKN2A等肿瘤抑制基因的失活（图3，B和C）。在KITL576P / TP53或KITK642E / TP53环境中靶向SPRED1可显着加速斑马鱼模型中黑色素瘤的发作（图3B）。相反，BRAFV600E / TP53或NRASQ61R / TP53环境中的SPRED1失活对黑色素瘤起病没有显着影响（图3，C和D）。斑马鱼黑色素细胞中的SPRED1失活也加速了KITK642E / cdkn2a环境中的肿瘤发作。相反，使用MiniCoopR载体的SPRED1过表达在突变体KIT的背景下显着延迟了体内黑色素瘤的发展，但在突变体BRAF的背景下没有。靶向SPRED1除了PTEN和TP53在晚发性黑色素瘤中再次受累，当单独靶向pten和tp53时未观察到（图3E）。因此，在TP53失活的情况下，SPRED1失活加速了斑马鱼中的黑色素瘤起始与突变体KIT表达或PTEN失活。这些结果将SPRED1确立为黑色素瘤中的真正肿瘤抑制基因，并证明了SPRED1缺失和激活KIT突变之间的体内协作。 图3
人黑色素瘤细胞系WM3211携带KITL576P突变并具有完整的SPRED1。作者发现在WM3211细胞中shRNA介导的SPRED1敲减增加了细胞增殖和MAPK活性（图4，A和B）。在BRAF驱动的黑色素瘤细胞中SPRED1敲减后未观察到这些作用。相反，WM3211细胞中SPRED1的过度表达降低了细胞增殖和MAPK活性。这些数据表明SPRED1调节KIT突变的黑色素瘤中MAPK活化和细胞增殖。shRNA引起的SPRED1下调与用KIT抑制剂达沙替尼处理的WM3211细胞中持续存在的低水平、可检测的ERK磷酸化水平相关（图4B）。 SPRED1敲减也抑制了达沙替尼的抗增殖作用（图4C）。说明这种对KIT抑制的抗性至少部分是由于MAPK活性增强，因为它可以被trametinib介导的MEK抑制消除（图4D）。在达沙替尼处理的WM3211细胞培养物中SPRED1移码突变体等位基因的比例随着时间的推移急剧增加（图4E）。为测试SPRED1缺失对KIT突变肿瘤治疗的影响而设计了一种方案，每天用沙替尼治疗KIT突变黑色素瘤的成年斑马鱼，治疗14天，发现肿瘤显著减小。然而，SPRED1敲除同时也减少了对KIT的抑制反应（图4F）。这些数据表明KIT突变黑色素瘤中，SPRED1缺失通过维持MAPK信号传导和细胞增殖来抑制KIT，说明SPRED1编码是RAS-MAPK信号转导通路的一种负调节因子。 图4
研究表明SPRED1是粘膜黑色素瘤的主要肿瘤抑制基因，筛查黑色素瘤中的SPRED1状态，尤其是KIT突变的患者，对其临床和治疗决策有一定的作用。最后，研究也说明了人类肿瘤基因组分析结合体内建模在识别癌症驱动因子方面的能力。
参看文献: Julien Ablain1, Mengshu Xu, Harriet Rothschild1, et al. Human tumorgenomics and zebrafish modeling identify SPRED1 loss as a driver of mucosalmelanoma. Science. 2018, 30;362:1055-1060.
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