穿山龙及其活性成分新用途的制作方法

专利名称：穿山龙及其活性成分新用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及中药穿山龙及其提取活性成分薯蓣皂甙等新用途。具体讲是穿山龙在制备抗肿瘤药物与对抗肿瘤化学药物具有增效药物中的应用；穿山龙提取的活性成分薯蓣皂甙在制备抗肿瘤药物与对抗肿瘤化学约物具有增效药物中的应用；穿山龙提取的其他活性成分在制备抗肿瘤药物与对抗肿瘤化学药物具有增效药物中的应用。
我国中医中药在这方面有得天独厚的优势和广泛研究前景，特别是利用中药抗肿瘤，具有毒副作用少，能够提高患者生活质量，延长生存期，提高机体整体功能等作用。发明人根据多年临床经验和现代研究成果，进行了多味中药体外抑制研究，近年发现临床常用的活血化痰中药“穿山龙”具有较好抗肿瘤效应。
穿山龙为薯蓣科薯蓣属植物穿山薯蓣(Dioscorea nipponica Mak)根茎。其性味甘、苦、温。归心、肺经。有活血舒筋、消食利水、祛痰截疟功效。临床用于治疗风寒湿痹、慢性咳嗽、哮喘、消化不良、劳损扭伤等。民间用其治疗筋骨麻木和腰酸腿痛。近代研究证明，穿山龙有调节免疫、改善心血管功能、镇咳、祛痰、平喘等多种药理作用。其中，穿山龙治疗类风湿关节炎、冠心病心绞痛、慢性气管炎、慢性布鲁氏菌病、脂肪瘤疗效较好。
1.成分研究穿山龙主要成分为甾体皂甙类，包括薯蓣皂甙(Dioscin)、纤维皂甙(Gracillin)和水溶性皂甙。总皂甙经水解后产生薯蓣皂甙元(Diosgenin)。薯蓣皂甙元的平均含量为0.93％～2.26％。穿山龙的有效成分还包括生物碱盐类、黄酮甙类、强心甙类等。
2.药理作用穿山龙的药理作用较为广泛，其文献研究主要药理作用与该药主治功能有密切关系。
(1)对机体免疫功能影响穿山龙水煎剂给药7天，能引起小鼠胸腺萎缩，外周血淋巴细胞ANAE阳性率降低及DNCB所致皮肤迟发反应型超敏反应受抑，血清溶血素形成下降，但对脾脏重量和结构无明显影响。穿山龙并能够使小鼠腹腔巨噬细胞吞噬鸡红细胞百分率和吞噬指数增加与血清溶菌酶含量升高。说明穿山龙对细胞与体液免疫均有抑制作用，而对吞噬细胞吞噬功能有增强作用。其对机体免疫功能影响机制有待进一步研究。
(2)对心血管作用总皂甙10mg/kg即能使兔血胆固醇从29.04mmol/L降低到8.06mmol/L，还可以减慢心率，增强心肌收缩力，增加每日尿量，降低β/α脂蛋白比例，改善冠脉循环，降低动脉血压，尤其适用于轻、中度动脉粥样硬化。通过试验研究亦证明穿山龙水溶性皂甙能够显著增加心肌营养性血液流量。
(3)镇咳作用小鼠氨水引咳法证明，口服总皂甙、水溶性或水不溶性皂甙、分子筛1号和腹腔注射煎剂，都有明显的镇咳作用，薯蓣皂甙元无效。镇咳的有效成分主要在极性最强部分。此外，甾体皂甙在较大剂量时也有效。有人从水溶性成分中分离出对羟苄基酒石酸，40mg/kg即有显著镇咳作用。
(4)祛痰作用小鼠酚红法表明灌服总皂甙、水不溶性皂甙、分子筛1号或腹腔注射煎剂均有显著祛痰作用，水溶性皂甙效果不显著。
(5)平喘作用豚鼠组胺喷雾法证明，灌服穿山龙制剂0.15g/kg及0.25kg/kg剂量，喘息抑制率分别为70％及100％。
(6)抗变态反应穿山龙水煎剂及其有效成分薯蓣皂甙有抑制致敏豚鼠肺碎片介质释放作用，认为有抗变态反应作用。进一步观察证明，著蓣皂甙无此作用，水煎剂在离体豚鼠回肠和离体家兔肠管上直接抗组织胺、抗乙酰胆碱和抗5羟色胺的作用。用穿山龙针剂对136例患者进行布氏菌素皮内变态反应试验，近、远期效果都较好，能明显降低阳性率(P＜0,01)，实验观察到强度与药量有平行关系，认为其脱敏机理主要是抑制介质释放，大剂量可能有抗组织胺作用。
3.临床应用(1)治疗类风湿性关节炎穿山龙注射液(1g/ml，2ml)肌注治疗类风湿性关节炎45例，显效率40％，好转率43.3％，总有效率83.3％，无明显副作用，近期疗效平较好。穿山龙针剂治疗布鲁菌病合并风湿性关节炎患者24例(抗“0”1∶400以上)，治疗后15例抗“0”下降，其中11例消失，认为可能与穿山龙抑制链球菌作用及含甾体有关。
(2)治疗冠心病心绞痛穿山龙根茎以水及乙醇为溶剂提取，经乙醚沉淀制得穿山龙冠心宁。经临床证明，对冠心病心绞痛有显著疗效，有效率为90.68％；对心悸、气短、胸闷等症状有较好疗效，有效率为77.30％，能改善冠状动脉供血不足；对冠心病合并高血压有一定降压作用，对高甘油三酯血症有较好疗效。
(3)治疗慢性支气管炎穿山龙软片水煎剂治疗37例，总有效率为86％；穿山龙片治疗142例者，有效73例，占61％，显效以上47例，占33％，从分型来看，对单纯型和虚阻型疗效较高，有效率分别为86％和82％。对咳、喘、痰均效果良好，对反复感染的痰阻型效果很差。其作用特点是起效较慢，但持续时间长。此外，还可以使患者食欲增加，握力增加，这与《神农本草经记载》的“薯蓣补虚赢，补中益气，长肌肉”的观点一致。
(4)治疗慢性布鲁菌病有研究表明，采用穿山龙深部肌肉注射，隔日或每日一次，治疗慢性布鲁氏菌病，共治疗3个疗程，市售药品与自制药品临床总有效率分别为93.1％与93％，在治疗过程中少数患者出现鼻衄，个别女性患者月经量增加；同时，极个别患者肌肉注射后局部红肿。
(5)治疗脂肪瘤以穿山龙250g，在2000ml白酒(60度)中浸泡15天，治疗一肩周炎患者，结果对肩周炎疗效不显著，而意外发现对肩周部位的脂肪瘤疗效满意。
综合上述，80年代以来对穿山龙及其主要成分、药理作用和临床应用方而研究取得了较好成绩，特别对穿山龙主要成分药理作用研究较为深入。现已发现的主要药理作用为抗类风湿、抗炎、扩张支气管平滑肌、改善冠脉血流等。但是，穿山龙临床应用非常广泛，是否还有其它重要药理作用，值得进行深入研究。基于这一原因，我们在临床应用的基础上，对穿山龙抗肿瘤效应进行了基础性研究，结果发现穿山龙主要成分薯蓣皂甙体外与动物实验均具有较为明显抗肿瘤作用。

发明内容
本发明目的是研究穿山龙及其活性成分抗肿瘤新用途。
为了进行本发明的实验研究，首先从穿山龙植物药中提取活性成分，制成实验用药样品。
穿山龙制剂制备1.制备工艺穿山龙粉碎成粗粉，加入70％乙醇加热回流提取，提取液回收乙醇至无醇味，浓缩至一定密度的稠膏，减压烘干，粉碎成细粉(测定半成品中薯蓣皂甙元含量，应达到50％以上)，即得实验用药样品。再加3％HPMC水溶液，置离心造粒机中，制得球形微丸，再以OPRY为防潮材料包衣后，按量装入胶囊，即为申报中药新药制剂。
2.制备工艺考察(1)回流提取时乙醇浓度、提取次数、每次乙醇用量。
(2)如半成品含量不符合规定，要制定分离、精制的方法。
(3)稠膏的相对密度范围。
3.理化性质穿山龙为薯蓣科植物穿龙薯蓣(Dioscorea nipponica Makino)的干燥根茎。收载于《北京市中药炮制规范》1986年版与《中国药典》1977版。主要成分为薯蓣皂甙(Dioscin)、薯蓣皂甙元(Diosgenin)、水溶性甙类、生物碱盐类、黄酮甙类、强心甙类、淀粉、纤维素等。薯蓣皂甙含量在2％左右。薯蓣皂甙元含量在3.5～4.2％之间。薯蓣皂甙为甾体皂甙，可溶于水，易溶于热水、稀醇、热甲醇和热乙醇中，几乎不容于乙醚、苯等极性小的有机溶剂。薯蓣皂甙元则不溶于水，而溶于石油醚、苯、乙醚、氯仿等低级性溶剂中。根据其性质，为充分提取有效成分皂甙类，弃去淀粉等杂质，拟采用70％乙醇回流提取方法制备半成品。以薯蓣皂甙元为质控测定指标。
4.质量标准用高效液相色谱法测定薯蓣皂甙元(C27H42O3)的含量，确定限度。
实验例1穿山龙主要成分体外抑制研究本实验选择QBC、PC3等八株肿瘤细胞进行体外抑制研究，以评价穿山龙主要成分抑制效果。
一、材料与方法1.细胞复苏(1)概述细胞复苏应采用快速融化方法，以保证细胞外结晶在很短时间内融化，避免水分渗入细胞内形成胞内再结晶对细胞造成损害。
(2)用品培养液、吸管、离心管、培养瓶、带盖搪瓷罐。
(3)步骤①从保存安瓿的小袋内或支架上取出安瓿直接投入37℃温水中，并不时摇动令其尽快融化。如果安瓿熔封不严，在保存过程中液氮进入安瓿中，从液氮罐中取出时由于温度升高导致液氮急速气化而爆炸，飞溅的玻璃碎片可伤害面部等。因此，存取安瓿时要佩戴眼镜和手套，安瓿投入存放有温水的器皿后应立即扣盖，以防发生意外；②从37℃水浴箱中取出安瓿，用酒精消毒后折断颈部，用吸管吸出细胞悬液，注入离心管并滴加10倍以上培养液，混合后低速离心，去上清液，再重复用培养液洗一次；③用培养液适当稀释后，接种培养瓶，放入37℃温箱静置培养，次日更换一次培养液，继续培养。如果复苏时细胞密度较高应及时传代。细胞复苏时细胞数可以做10～20倍稀释，接种密度以5×105/ml为宜。
2.肿瘤细胞培养(1)用品含10％小牛血清的1640培养液、PBS缓冲液、吸管、酒精灯、无菌操作台。
(2)操作方法将复苏的肿瘤细胞放在37℃温箱静置培养，次日更换一次培养液，继续培养，并根据细胞生长情况每日或隔日在无菌操作台中更换培养液。更换培养液时尽量避免各种可能的途径污染。
(3)注意事项①当癌细胞还没有生长到足以覆盖培养瓶壁大部分表而以前，应耐心等待，不要急于传代；②癌细胞经常重叠生长，如果混有成纤维细胞，可用吸管吹打或低浓度胰蛋白酶消化，分离出癌细胞并传代培养；③从原代开始到10代左右期间，培养细胞增殖极不稳定。因此，在传代操作中必须谨慎，并且确定适合该细胞的培养方法。早期传代培养，应适当提高接种细胞密度；④对于增殖能力极低的细胞，可用经5000拉得照射的成纤维细胞单层培养作为饲养层，或者向培养液中加一种或几种促细胞生长物质。根据细胞种类不同选用不同的促生长物质，常用胰岛素、氢化可的松、雌激素以及表皮生长因子、转铁蛋白等因子；⑤在成纤维细胞同癌细胞长期共存情况下，希望对癌细胞进行选择性传代。而成纤维细胞常常生长较快，并常超过癌细胞，导致癌细胞生长受阻以至消失。因此，消除成纤维细胞是癌细胞培养中的重要条件。
3.细胞传代(1)概述不同的细胞应采取不同的细胞传代方法。贴壁生长细胞用消化传代法；部分贴壁生长细胞用直接吹打即可传代；悬浮生长细胞可以采用直接吹打或离心分离后传代，或用自然沉降法吸除上清液后，再吹打传代。
(2)用品①0.25％胰蛋白酶或其它消化液、培养液、PBS缓冲液或Hanks液；②滴管、离心管、培养瓶、培养瓶盖、注射器、记数板、橡皮乳头等。
(3)步骤①贴壁细胞消化法传代A吸除或倒掉瓶内旧培养液；B以25ml培养瓶为例，向瓶内加入1ml消化液(胰蛋白酶)轻轻摇动培养瓶，使消化液覆盖细胞表面，然后吸掉或倒掉后再加1～2ml新的消化液，轻轻摇动后再倒掉大部分消化液，仅留少许进行消化。也可不采取上述步骤，直接加消化液进行消化；C消化最好在37℃或室温25℃以上环境下进行。消化2～5min后把培养瓶放置在显微镜下进行观察，发现胞质回缩、细胞间隙增大后，应立即终止消化；D吸除或倒掉消化液，如果用EDTA消化，需加Hanks液数毫升，轻轻转动培养瓶把残留消化液冲掉，然后再加培养液。如仅用胰蛋白酶可直接加少许含血清培养液，终止消化；E用弯头吸管，吸取瓶内培养液，反复吹打瓶壁细胞，吹打过程要顺序进行，以确保所有底部都被吹到。吹打时动作要轻柔，尽可能不出现泡沫，以防止对细胞造成损伤；F记数，分别接种在新的培养瓶内。②悬浮细胞传代A因悬浮细胞生长不贴壁，故传代时不必采用酶消化方法，可直接传代或离心收集细胞后传代；B直接传代即让悬浮细胞慢慢沉淀在瓶底后，将上清吸掉1/2～2/3，然后用吸管吹打形成细胞悬液后，再传代；C悬浮细胞多采用离心方法传代，即将细胞连同培养液一并转移到离心管内，以800～1000rpm，离心5min，然后去除上清液，加新培养液到离心管内，用吹管吹打使之形成细胞悬液，传代接种。③部分贴壁生长细胞，不经消化处理直接吹打也可使细胞从壁上脱落下来，而进行传代。但这种方法仅限于部分贴壁不牢的细胞，如Hela细胞等。直接吹打对细胞损伤较大，且常有较大数量丢失，因而，绝大部分贴壁生长的细胞均需消化后才能吹打传代。
4.细胞冻存(1)概述实验中多余细胞应该冻存以备后用。冻存细胞时要缓慢冷冻。因为细胞在未加任何保护剂的情况下直接冷冻时，细胞内外的水分都会很快形成冰晶，冰晶形成将引起一系列不良反应。首先细胞脱水使局部电解质浓度增高，PH值改变，部分蛋白质变性，引起细胞内部空间结构紊乱；细胞内冰晶的形成和细胞膜系统上蛋白质、酶变性，引起溶酶体膜损伤，使溶解酶释放造成细胞内结构成分破坏，线粒体肿胀、功能丧失并造成细胞能量代谢障碍；胞膜上的类脂蛋白复合体在冷冻中易发生破坏引起胞膜通透性改变，使细胞内容物丧失；细胞核内DNA也是冷冻时细胞易受损部分，如细胞内冰晶形成较多，随冷冻温度的降低，冰晶体积膨胀造成DNA的空间构型发生不可逆的损伤性变化，而引起细胞死亡。
细胞冻存时要尽可能均匀地减少细胞内水分，减少细胞内冰晶的形成是减少细胞损伤的关键。目前多采用甘油或二甲基亚砜(DMSO)作保护剂。这两种物质对细胞无明显毒性，分子量小，溶解度大，易穿透细胞，可以使冰点下降，提高胞膜对水的通透性；加上缓慢冷冻方法可使细胞内水分渗出细胞外，在胞外形成冰晶，并减少细胞内冰晶形成，从而减少由于冰晶形成造成的细胞损伤。
(2)用品①0.25％胰蛋白酶；②含10％～20％血清培养液；③DMSO(分析纯)或无色新鲜甘油(15磅蒸汽高压消毒)；④吸管、离心管、2ml安瓿(或冻存管)；⑤喷灯(或其它安瓿封口设备)(3)步骤①从增殖期到形成致密单层细胞以前培养的细胞都可以用于冻存，但最好为对数生长期细胞，已经长满的细胞冻存后生存率低。在冻存前一天最好换一次培养液；②用胰蛋白酶把单层生长的细胞消化下来，悬浮生长的细胞则不需处理。依据传代方法把消化好的细胞收集于离心管并计数，离心；③去除胰蛋白酶及日培养液，加入配制好的冻存培养液(含10％DMSO或甘油)，冻存液中细胞最终密度为5×106/ml～10×106/ml。用吸管轻轻吹打使细胞均匀，然后分装入无菌安瓿中，每安瓿或冻存管加液1～1.5ml；④用火焰将安瓿熔封。熔封时必须保证安瓿完全封闭，同时注意不能使安瓿内细胞悬液温度升高。安瓿上应写明细胞名称。装入已做标记的小袋或支架同时作好记录；⑤封好安瓿即可直接冻存。标准冻存程序为降温速率-1～-2℃/min；当温度达-25℃以下时，可逐步下调温度，到-100℃时，则可迅速浸入液氮中。要掌握适当降温速度，过快会影响细胞内水份透出，太慢则促进冰晶形成。各种细胞对冷冻耐受性不同，上皮细胞和成纤维细胞耐受性大，骨髓细胞差一些，以-2～-3℃/min合适，而胚胎细胞耐受性最小。总之，在开始时温度下降速度不能超过-10℃/min。要粘确控制冷冻速度需要细胞冻存器，如无此设备一般可以采用以下几种冻存力法来控制冷冻速率A首先将安瓿直立放置于塑料盒或小纸盒中，周围固定，以免倾倒。这是因为安瓿颈口部一般较薄，冻存时易被膨胀的冰挤破。将安置好的小盒放入-70℃冰箱中，经过3h以后，取出安瓿移入液氮容器内；B可将标记好的安瓿装入小袋或支架，从液氮容器口缓缓放入，按-1℃/min的降温速度，在30～40min时间内使其到达液氮表而。再停30min后，直接投入液氮中。
现在冻存细胞除用安瓿外，还有一种特制的塑料螺口小瓶，使用方便而且不会炸裂。但有如质量不好，有时密封不严等问题，因而使用前要仔细检查。
细胞冻存后，留在液氮容器外的系线要做好标记并做到沿着罐口顺序摆放，以免互相缠绕拿取不方便。液氮数量要定期检查，如发现液氮挥发要及时补充。补加液氮时要做好眼、手、脚等身体暴露部位防护以免冻伤。细胞在液氮中储存时间理论上是无限的，但为妥善起见，特别是很多末被冻存过的细胞在首次冻存后要在短期内复苏一次观察细胞对冻存的适应性。已建系的细胞最好也每年复苏一次后，再继续冻存。
5.细胞培养污染检查和排除组织细胞培养工作过程中，污染可能发生。与组织细胞培养有关的研究项目除了良好实验设计和技术方法外，关键因素之一是避免污染。
污染不仪仅指微生物，还包括所有混入培养环境中，对细胞生存有害的成份和造成细胞不纯的异物，因此，一般包括生物(真菌、细菌、病毒和支原体)、化学物质(影响细胞生存、非细胞所需的化学成份)及细胞(非同种的其它细胞)。其中，以微生物污染最多见。随着细胞种类增多，不同种细胞交叉污染也时有发生，从而造成细胞不纯。因此，在组织细胞培养工作中，应该了解和解决有关微生物污染及细胞交叉污染的问题。
(1)微生物污染途径微生物污染可通过多种途径发生。①空气空气是微生物传播的最主要途径。空气流动性大，培养操作场地与外界隔离不严或消毒不充分，外界不洁空气很容易侵入造成污染。因此，培养设施不能设在通风场所。现各实验室普遍应用净化工作台，可有效防止不洁空气侵入。但如净化工作台使用过久，滤器受尘埃阻塞，可使净化工作不能正常进行。工作时不戴口罩大声讲话、咳嗽等使外界气流过强，污染空气可侵入探作野，造成污染。因此，工作时减少空气流动是防止污染的重要环节。②器材各种培养器皿及器械清洗消毒不彻底。例如洗刷不干净，污物残留及培养用液等灭菌不彻底都可以引入有害物质。另外，需要注意的是由于温箱内湿度大，温度适宜，取存细胞时不慎将培养液漏出，易使细菌、霉菌孳生。又因细胞在CO2温箱内是开放式培养，如不定期对CO2温箱消毒，可造成污染。③操作实验操作无菌观念不强、动作不准确、使用污染器具，或封瓶时不严，都可发生污染。培养两种以上细胞时，操作不规范、交义使用吸管或营养液瓶等有可能导致细胞交叉污染。④血清有些血清在生产时就己被支原体或病毒等污染，可成为细胞培养污染的来源。⑤组织样本原代培养污染多数来源于组织样本；另外手术时使用碘酒消毒，这些混入组织中的碘可以影响细胞生长。
(2)微生物污染对细胞的影响由于体外培养细胞自身没有抵抗污染能力，而且培养基中加入抗菌素抗污染能力也很有限，因而，一旦细胞发生污染多数将无法挽救。一般在细胞受到有害物污染早期或污染程度较轻时，如能及时处理并去除污染物，部分细胞有可能恢复。但若污染物持续存在于培养环境中，造成轻度污染者细胞生长缓慢，分裂相减少，细胞变得粗糙，轮廓增强，胞浆出现较多颗粒状物质；较重时细胞增殖停止，分裂相消失，胞质中出现大量的堆积物，细胞变圆或崩解，从瓶壁脱落。
不同污染物对细胞的影响也有差别。微生物中支原体和病毒对细胞形态和机能影响具有长期、缓慢和潜在的特性；而霉菌和细菌繁殖迅速，能在很短时间内抑制细胞生长或产生有毒物质杀灭细胞；化学物质污染，如重金属或其它化学试剂混入培养液中，若毒性较小，并能及时排出，细胞仍可存活，但有些烃化物，如多环芳烃等有致突变性，能导致细胞发生转化。
(3)微生物污染的检测①真菌污染真菌利类很多，细胞培养污染多为烟曲菌、黑曲菌、毛霉菌、孢子菌、白念菌、酵母菌等。霉菌污染后多数在培养液中形成白色或浅黄色漂浮物，肉眼可见，较易被发现，短期内培养液多不浑浊，倒置显微镜下可见细胞之间有纵横交错穿行的丝状、管状及树枝状菌丝，并悬浮飘荡在培养液中。很多菌丝在高倍镜下可见到链状排列菌珠；念珠菌或酵母菌形态呈卵形，散在细胞周边和细胞之间生长。有时通过显微镜观察可能发现瓶底外面生长的菌丝，不要错当培养瓶内污染。瓶外污染物，需及时用酒精棉球擦洗清除，以防其通过瓶口传入瓶内。②细菌污染细菌污染较多见的是大肠杆菌、白色葡萄球菌、假单孢菌等。加用抗菌素的培养液一般可预防和排除少量细菌污染。一旦发生细菌污染很易发现，多数情况下培养液短期内变黄，表明有大量酸性物质产生，出现明显浑浊现象；有时静置培养瓶液体初看不浑，但稍加振荡，就有浑浊物漂起。倒置显微镜下可见培养液中有大量圆球状颗粒漂浮，有时在细胞表面和周围有大量细菌存在，细胞生长停止并有中毒表现。必要时可取少量培养液涂片染色检查以证实细菌种类；有的培养液改变不归显而又疑有污染，亦可向肉汤培养基内滴入少量培养液，37℃培养后检测。细菌和霉菌污染多在传代、换液、加样等开放性操作之后发生，而且由于增生迅速，多在发生污染48h以内就已明显。因而，在实验最初两天内密切观察实验样本是否有污染发生，如有，因及时采取措施予以补救或排除。③支原体污染支原体污染是常见而又棘手的问题。近几年随着实验设备和技术方法改进，支原体污染的防治有了一定进展。
支原体是大小介于细菌和病毒之间(最小直径0.2μm)，并独立生活的微生物，约有1％可通过滤菌器。支原体无细胞壁，形态呈高度多形性，可为圆形、丝状或梨形。
支原体形态多变，在光镜下不易看清内部结构。电镜下观察支原体膜为三层结构，其中央有电子密度大的密集颗粒群或丝状中心束。支原体多吸附或散在于细胞表面或细胞之间。横断面与细胞微绒毛相似，但微绒毛电子密度比支原体小，且中央无颗粒群或中央束。
支原体代谢需固醇类物质，部分种类需要精氨酸、氧气或葡萄糖，每种支原体都有自身特点。多数支原体适合偏碱条件下生存(PH7.6～8.0)，对酸耐受性差，对热比较敏感，对一般抗生素不敏感。
支原体污染后，培养液可不发生浑浊，多数细胞病理变化轻微或不显著，细微变化也可由于传代、换液而缓解，因此，易被忽视。但个别严重者可导致细胞增殖缓慢，甚至从培养器皿脱落。为确定有无支原体污染可作A.相差显微镜检测；B.荧光染色法；C.电镜检查；D.DNA分子杂交检查或支原体培养等方法。
(4)微生物污染防治培养细胞污染一旦明确，多数将无法救治，如果污染细胞不具有重要价值，一般发现污染后应尽快弃之，以防污染扩大影响其它细胞。因此，应尽力预防污染发生。预防关键在于严格无菌操作，把好每一关口，尽可能禁止其它污染物品进入培养操作环节。为防止污染和抢救有价值细胞，目前一般可采用以下措施①抗生素应用抗生素主要用来杀灭微生物，而细胞培养工作采用抗生素多为预防污染。一般多联合应用。细胞培养中常用抗生素及用量如下青霉素G100～1000U/ml；链霉素100～1000μg/ml；庆大霉素50～200μg/ml；卡那霉素100～1000μg/ml；四环素10～50μg/ml；红霉素50～100μg/ml。其中，四环素和卡那霉素对支原体有一定抑杀作用，以四环素作用较强。已发生微生物污染后再使用抗生素常常难以根除，有的抗生素对细菌仅有抑制作用而无杀菌效应，反复应用还会使微生物产生耐药性，而且对细胞生长也有一定影响。因此，有人主张培养液中不加抗生素。但当有价值细胞遭受污染时，还需用抗生素抢救，一般用预防量的5～10倍来作冲击疗法。用药24～48h后，再换常规培养液，在污染早期可能奏效。②温处理根据支原体对热敏感的特点，将受支原体污染细胞放置在41℃作用5～10h，最长不超过18h，以杀灭支原体。但高温度对细胞生长也有很大影响，因而，在实验前应先用少量细胞作试验以找出最佳时间和温度，尽可能保证既杀灭支原体又使细胞不致受到太大损伤。③动物体内接种将受支原体污染的细胞接种在同种动物皮下或腹腔，借动物体内免疫系统消灭支原体。待一定时间后取出细胞，做原代培养繁殖。
除以上方法外，还有巨噬细胞吞噬法等对付支原体方法，但较为繁琐，效果不尽人意。目前，国外已有能滤除支原体的新型滤膜系统，可以去除受污染培养用液中的支原体，但不能去除附在细胞上的支原体。
(5)细胞交叉污染细胞培养中要注意另一问题是防止细胞间交叉污染。细胞污染和细菌污染不同，细胞污染是由于在培养操作过程中各种细胞同时进行，而所用器具或液体混杂使用所致，这种污染没有微生物存在，但使培养细胞不同种类之间发生混乱，细胞生长特性、形态发生变化，有些变化较轻微、不易察觉，有些则可能由于污染细胞具有生长优势超过原来细胞而导致被污染细胞生长抑制或死亡。污染细胞由于种类不纯，无法进行实验研究。为有效防止细胞交叉污染发生应做到以下几点①在进行多个种类细胞培养操作时，所用器具要严格区分，最好作上标记便于辨别。对每一种细胞按顺序进行操作，避免一起进行时发生混乱。②进行换液或传代操作时，注射器和滴管不要接触培养液瓶瓶口，以免把细胞带到培养液瓶中，防止进行其它细胞培养操作时导致细胞污染。③所有从别处转来细胞或自己所建细胞系都要在早期留有充足冻存储备，一旦怀疑发生细胞交叉污染，可作细胞遗传学鉴定，如发现原有标志性遗传物质发生改变，可以复苏早期冻存细胞使用。
6.四唑盐(MTT)比色试验(1)概述四唑盐比色试验是检测细胞存活和生长的方法。试验所用显色剂四唑盐是一种能接受氢原子染料，化学名为3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴盐，商品名是噻唑蓝，简称为MTT。活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能使外源性MTT还原为难溶性蓝紫色结晶物(Formazan)并沉积在细胞中，而死细胞无此功能。二甲基亚砜(DMSO)能溶解细胞中紫色结晶物，用酶联免疫检测仪在490nm波长处测定其光吸收值，可间接反映活细胞数量。在一定细胞数范围内，MTT结晶物形成量与细胞数成正比。该方法已广泛用于一些生物活性因子检测、大规模抗肿瘤药物筛选、细胞毒性试验以及肿瘤放射敏感性测定等。其特点是灵敏度高、重复性好、操作简便、经济、快速、易自动化、无放射性污染，与其他检测细胞活力方法(如细胞计数法、软琼脂克隆形成试验和3H-TdR掺入试验等)有良好相关性。
(2)用品①穿山龙主要成分薯蓣皂甙2mg/ml(无菌、由北京中医药大学中药学院提供)；②肿瘤细胞株名称及来源胆管癌(QBC)细胞株由第三军医大学西南医院肝胆中心提供；胰腺癌(PC3)细胞株由协和医科大学免疫室提供；巨核白血病细胞株(Mo7e)由中国军事医学科学院放射二所三室提供；白血病早幼粒细胞株(HL-60)由中国军事医学科学院放射二所一室提供；红白血病细胞株(K562)由中国军事医学科学院血液九所提供；乳腺癌细胞株(MCF-7)由中国军事医学科学院放射二所一室提供；肝癌细胞株(7721)由中国军事医学科学院放射二所一室提供；口腔上皮癌细胞株(KB)由中国军事医学科学院放射二所一室提供。③MTT溶液称取250mgMTT，放入小烧杯中，加50mlPBS(0.01mol/L，pH7.4)在电磁力搅拌机上搅拌30min，用0.22μm微孔滤器除菌，分装，4℃保存，两周内有效。④含10％胎牛血清RPMI1640培养液、0.25％胰蛋白酶、二甲基亚砜(DMSO)。⑤96孔培养板(单层生长的细胞选用平底型培养板，悬浮生长的细胞选用圆底型培养板)、可调移液器、吸管、离心管、计数板。⑥CO2孵箱、显微镜、振荡混合仪、酶联免疫检测仪。
(3)步骤①用0.25％胰蛋白酶消化单层培养细胞，用含10％胎牛血清的RPMI1640培养液配成单个细胞悬液，以每孔103～104个细胞接种于96孔培养板中，并加入含薯蓣皂甙浓度不等的培养液，每孔体积为200μl；②将培养板移入CO2孵箱中，在37℃、5％CO2及饱和湿度条件下，培养3～5天.(培养时间取决于实验目的和要求)；③培养第3～5天后，每孔加入MTT溶液(5mg/ml)20μl，37℃，继续孵育4h，终止培养，小心吸弃孔内培养上清液。对于悬浮生长的细胞，需离心(1000rpm，5min)，然后弃去孔内培养液。每孔加入150μl DMSO，振荡10min，使结晶物充分溶解；④选择490nm波长，在酶联免疫检测仪上测定各孔光吸收值，记录结果。计算出抑制率，并绘出抑制图。
(4)注意事项①选择适当细胞接种浓度。一般情况下，96孔培养板的一个孔内贴壁细胞长满时约有105个细胞。但由于不同细胞贴壁后所占面积差异很大，因此，在进行MTT试验前，对每一种细胞都应测其贴壁率、倍增时间以及不同接种细胞数条件下生长曲线，然后确定试验中每孔接种细胞数和培养时间，以保证培养终止时不致细胞过满。这样，才能保证MTT结晶形成量与细胞数呈良好线性关系；②避免血清干扰。用含15％胎牛血清培养液培养细胞时，高浓度血清物质会影响试验孔光吸收值。由于试验本底增加，会降低试验敏感性。因此，一般选小于10％胎牛血清培养液进行试验。在呈色后，尽量吸净培养孔内残余培养液；③设空白对照。与试验孔平行设置不加细胞只加培养液空白对照孔。其它试验步骤保持一样。最后比色时，以空白孔调零。
(二)实验结果1.薯蓣皂甙对各肿瘤细胞株抑制效果(1)薯蓣皂甙对QBC细胞株抑制效果，结果见表1。
表1、薯蓣皂甙对QBC细胞抑制效果组别药浓度(μg/ml)OD值(X±S) 抑制率(％)1 0.0 0.93±0.0302 1.5 0.95±0.1003 3.0 0.97±0.1504 6.0 0.91±0.042.25 12.0 0.64±0.0231.26 24.0 0.17±0.0381.7注96孔板培养48小时，每孔培养液200μl，细胞约1万个(下同)表1说明薯蓣皂甙浓度在6.0～24μg/ml范围内对QBC细胞抑制有剂量依赖关系。
(2)薯蓣皂甙对PC3细胞抑制效果，结果见表2。
表2、薯蓣皂甙对PC3细胞抑制效果组别药浓度(μg/ml)OD值(X±S) 抑制率(％)1 0.0 0.60±0.0202 1.5 0.65±0.0403 3.0 0.56±0.036.74 6.0 0.54±0.0310.05 12.0 0.45±0.0425.06 24.0 0.14±0.0276.7表2说明薯蓣皂甙浓度在3.0～24μg/ml范围内对PC3细胞抑制有剂量依赖关系。
(3)薯蓣皂甙对Mo7e细胞抑制效果，结果见表3。
表3、薯蓣皂甙对Mo7e细胞抑制效果组别药浓度(μg/ml)OD值(X±S) 抑制率(％)1 0.0 0.91±0.0302 1.5 0.75±0.0817.83 3.0 0.81±0.1111.04 6.0 0.64±0.0229.75 12.0 0.44±0.0451.66 24.0 0.13±0.0385.7表3说明薯蓣皂甙浓度在3.0～24μg/ml范围内对Mo7e细胞有剂量依赖关系。
(4)薯蓣皂甙对HL60细胞抑制效果，结果见表4。
表4、薯蓣皂甙对HL-60细胞抑制效果组别药浓度(μg/ml)OD值(X±S) 抑制率(％)1 0.0 0.85±0.0502 1.5 0.65±0.0223.53 3.0 0.57±0.0632.94 6.0 0.55±0.0235.35 12.0 0.17±0.0480.06 24.0 0.03±0.0299.6表4说明薯蓣皂甙浓度在1.5～24μg/ml范围内对HL60细胞抑制有剂量依赖关系。
(5)薯蓣皂甙对K562细胞抑制效果，结果见表5。
表5、薯蓣皂甙对K562细胞抑制效果组别药浓度(μg/ml)OD值(X±S)抑制率(％)1 0.0 1.31±0.04 02 1.5 1.22±0.02 6.93 3.0 1.35±0.15 0.04 6.0 1.28±0.02 2.35 12.0 0.99±0.05 24.46 24.0 0.27±0.02 79.4表5说明薯蓣皂甙浓度在6.0～24μg/ml范围内对K562细胞抑制有剂量依赖关系。
(6)薯蓣皂甙对MCF-7细胞抑制效果，结果见表6。
表6、薯蓣皂甙对MCF-7细胞抑制效果组别药浓度(μg/ml)OD值(X±S)抑制率(％)1 0.0 1.26±0.07 02 1.5 1.26±0.03 03 3.0 1.07±0.05 15.14 6.0 0.76±0.08 39.75 12.0 0.25±0.04 80.26 24.0 0.20±0.03 84.1表6说明薯蓣皂甙浓度在3.0～24μg/ml范围内对MCF-7细胞抑制有剂量依赖关系。
(7)薯蓣皂甙对7721细胞抑制效果，结果见表7。
表7、薯蓣皂甙对7721细胞抑制效果组别药浓度(μg/ml)OD值(X±S)抑制率(％)1 0.0 0.92±0.08 02 1.5 0.84±0.06 8.73 3.0 0.92±0.14 0.04 6.0 0.71±0.06 22.85 12.0 0.39±0.03 57.26 24.0 0.14±0.02 84.8表7说明薯蓣皂甙浓度在6.0～24μg/ml范围内对7721细胞抑制有剂量依赖关系。
(8)薯蓣皂甙对KB细胞抑制效果，结果见表8。
表8、薯蓣皂甙对KB细胞抑制效果组别药浓度(μg/ml)OD值(X±S)抑制率(％)1 0.0 1.81±0.07 02 1.5 1.78±0.19 1.73 3.0 1.49±0.08 17.74 6.0 1.21±0.09 33.25 12.0 0.44±0.14 75.76 24.0 0.14±0.04 92.3表8说明薯蓣皂甙浓度在1.5～24μg/ml范围内对KB细胞抑制有剂量依赖关系。
2.薯蓣皂甙与长春新碱抗肿瘤活性比较(1)长春新碱对Mo7e细胞抑制效果，结果见表9。
表9、长春新碱对Mo7e细胞抑制效果组别药浓度(μg/ml)OD值(X±S) 抑制率(％)1 0.0 0.85±0.0302 0.2 0.44±0.0348.23 0.4 0.32±0.0262.34 0.8 0.24±0.0671.85 1.6 0.23±0.0272.96 3.2 0.20±0.0176.5
(2)长春新碱对HL60细胞抑制效果，结果见表10。
表10、长春新碱对HL-60细胞抑制效果组别药浓度(μg/ml)OD值(X±S)抑制率(％)1 0.0 0.64±0.04 02 0.2 0.69±0.13 0.03 0.4 0.60±0.02 6.34 0.8 0.51±0.05 20.35 1.6 0.45±0.07 29.76 3.2 0.47±0.14 26.7(3)长春新碱对K562细胞抑制效果，结果见表11。
表11、长春新碱对K562细胞抑制效果组别药浓度(μg/ml)OD值(X±S) 抑制率(％)1 0.0 1.36±0.0602 0.2 1.17±0.0214.03 0.4 1.19±0.1412.54 0.8 1.22±0.0410.35 1.6 1.08±0.0220.66 3.2 0.99±0.0227.2(4)长春新碱对MCF-7细胞抑制效果，结果见表12。
表12、长春新碱对MCF-7细胞抑制效果组别药浓度(μg/ml)OD值(X±S) 抑制率(％)1 0.0 1.16±0.03 02 0.2 1.14±0.12 1.703 0.4 1.01±0.03 12.94 0.8 0.90±0.03 22.45 1.6 0.84±0.03 27.66 3.2 0.60±0.02 48.3本研究是在近年来进行的多味中药体外抗肿瘤研究基础上，发现了其中穿山龙有较好的抑制作用。而该药为活血化痰药，正好与肿瘤系“痰瘀互结，日久成积”的中医病机相吻合。而且据药典记载该药性平、无毒，临床使用未见明显毒副反应，很可能开发出疗效好、毒副反应低的一、二类抗肿瘤新药。本实验证实在最大剂量(24.0μg/ml)下，薯蓣皂甙对QBC、PC3、K562、HL-60、MO7e、MCF-7、7721、KB八株肿瘤细胞的抑制率分别为81.7％、76.7％、79.4％、99.6％、85.7％、84.1％、84.8％、92.27％，属广谱抗肿瘤药物。与长春新碱比较该药最大浓度(24.0μg/ml)对各肿瘤细胞抑制率均在80％左右，而长春新碱除对Mo7e细胞最大浓度(3.2μg/ml)抑制率在76.5％外，其余均在50％以下。薯蓣皂甙最大浓度(24.0μg/ml)只相当于5克生药，远远低于15～30克的临床用量，而长春新碱最大浓度(3.2μg/ml)为12mg，远远高于2mg的临床用量。可见该药安全可靠，临床应用前景广阔。
本发明药物对QBC、PC3等八株肿瘤细胞均有较好的抑制效果，为广谱抗肿瘤药物。有效浓度低于临床用量。符合肿瘤“痰瘀互结，日久成积”的中医病机。
实验例2薯蓣皂甙体内抗肿瘤药效学研究一、材料与方法1.实验材料(1)实验动物模型雄性BALB/C小鼠，20±2g重，从军事医学科学院动物中心购买。小鼠乳腺癌移植细胞株，由军事医学科学院放射医学研究所放射毒理研究室提供。
(2)药品与主要试剂薯蓣皂甙先以1，2-丙二醇溶解，然后加入双蒸水稀释至所需浓度，药液中1，2-丙二醇的终浓度＜30％，过滤除菌，4℃保存。
(3)主要实验仪器及物品主要实验仪器名称如下仪器名称 产地OLYMPUS显微镜日本SA720型pH计 美国高速离心机 北京医疗仪器修理厂
ASC-02EAS电子秤北京市菲姆斯科技开发公司(4)小鼠饲养由军事医学科学院小动物饲养中心二级动物房统一饲养。
2实验方法(1)急性毒研究根据文献材料，静脉给药每日所用的安全剂量，合生药量为3g/60kg，本次试验所用样品的提取率为10g/kg(即1％)，小鼠腹腔给药量为0.2ml/只，试验分六组给药剂量分别为成人用药剂量的10倍、20倍、40倍(药物浓度分别为0.5mg/ml、1.0mg/ml、2.0mg/ml)，设相应浓度的1，2-丙二醇为对照组。每组8只BALB/C小鼠。
(2)体内抑制实验选用小鼠移植性肿瘤法。①复苏瘤株从细胞低温液氮储存罐中取出小鼠乳腺癌瘤株冻存管，置于37℃温水中快速解冻，于高速离心机上离心1500rpm 5min，弃去上清液，加入PBS液，细胞计数，调整细胞悬液浓度至107/ml个，以0.2ml/只接种于BALB/C小鼠的右后肢内侧皮下，15-20天后肿瘤生长至1g以上时即可传代。②接种瘤株断颈处死传代荷瘤小鼠，置于75％的酒精中浸泡10min，然后将其放置在洁净工作台内的大平皿中，用经高压消毒后的手术器械，剪开肿瘤处皮肤，钝性分离肿瘤包膜，取出肿瘤放入消毒后的PBS液中，清洗三遍，洗净血污及坏死组织，秤重，按每克肿瘤4ml PBS溶液的比例，剪碎瘤体，充分匀浆，制成细胞悬液，调整浓度为107/ml，每只BALB/C小鼠接种0.2ml于右后背部皮下。③分组与给药接种肿瘤后的第二天，秤重，根据体重随机分组，每组10只，共4组，分别为对照组(用双蒸水稀释，使1，2-丙二醇的含量为30％)、10mg/kg组(腹腔给药ip.)、25mg/kg组(口服灌胃po.)、5mg/kg组(口服灌胃po.)。
3.统计学处理(1)收集数据停药后第3天处死小鼠，取瘤秤重。
(2)计算方法采用下列公式计算。 (3)统计学处理采用SPSS计算机统计软件，进行方差分析、秩和检验。
二、结果1.急性毒研究结果2.0mg/ml(ip)剂量组小鼠在给药后可出现拉跨、竖毛、发抖及活动减少等现象，30min后恢复正常。对应浓度的1，2-丙二醇组无此现象发生。提示该浓度下201对小鼠有一定刺激作用，其余各组未发现任何异常。试验连续三天，小鼠无一死亡。
2.体内抑制结果(1)动物存活情况接种后第四天开始给药，以后每周给药5次，同时观察小鼠及其肿瘤生长情况。共给药三周。小鼠成瘤率100％。种瘤给药后的第26天对照组小鼠死亡一只，尸体解剖未发现异常。种瘤给药后的第27天10mg/kg(ip.)组小鼠死亡一只，死亡当日剥取瘤体秤重，尸体解剖未发现异常。
(2)不同给药剂量、途径的抑制作用本试验共分4组，治疗3组，对照1组，每组10只小鼠。共给药3周，停药后3天剥取瘤体称重、拍照。研究结果表明治疗各组肿瘤生长与对照组相比，皆呈一定的抑制现象，最大抑制作用产生在10mg/kg ip组，抑制率为39.46％，见表13。将四组肿瘤按瘤重大小分成三组，对照组肿瘤主要分布在＞2g组，其它三组肿瘤主要分布在≤1g组，经统计学处理对照组与其它三组瘤重分布差异显著，但其它三组之间瘤重分布无明显差异，见表14。用药前后小鼠体重变化无明显差异，见表15；高剂量用药组动物每次用药后出现深拉现象；两组灌胃组小鼠与对照组和腹腔注射组小鼠相比，一般状态较好，毛发有光泽，活动较灵活，反应敏锐。
表13、小鼠乳腺癌移植瘤瘤体重量分析(X±s；n＝10)组别 对照组10mg/kg(ip)25mg/kg(po)50mg/kg(po)瘤重(g)1.88±0.831.14±0.82 1.6±0.92 1.21±0.59抑制率(％) 39.46 38.24 35.85
表14、瘤重分组分析(n＝39)秩和检验*与对照组比p＜0.05，相差显著表15、用药前后小鼠体重分析(×±s；n＝10)组别 体重(g)用药前 用药后对照组19.14±0.9 19.02±1.1310mg/kg(ip) 19.22±1.3 19.05±1.1425mg/kg(po) 19.23±1.15 19.32±1.1650mg/kg(po) 19.03±1.19 19.12±1.17方差分析p＞0.05，相差不显著实施举例实施例1将穿山龙粉碎成粗粉，加入70％乙醇加热回流提取，提取液回收乙醇至无醇味，浓缩至一定密度的稠膏，减压烘干，粉碎成细粉(测定半成品中薯蓣皂甙元含量，应达到50％以上)，制备实验用样品。再加3％HPMC水瘤重(g)组别 P＝0.037*≤1＞1，＜2≥2对照组 0 4 51mg/ml*6 3 12.5mg/m*5 3 25mg/ml*6 3 1溶液，置离心造粒机中，制得球形微丸，再以OPRY为防潮材料包衣后，按量装入胶囊，即为新药制剂。
实施例2将实施例1所提取的薯蓣皂甙先以1，2-丙二醇溶解，然后加入双蒸水稀释，使药物浓度为0.5mg/ml，药液中1，2-丙二醇的终浓度＜30％，过滤除菌，制成注射剂。作为体外细胞培养与动物实验用样品。
实施例3将实施例1所提取的薯蓣皂甙先以1，2-丙二醇溶解，然后加入双蒸水稀释，使药物浓度为1.0mg/ml，药液中1，2-丙二醇的终浓度＜30％，过滤除菌，制成注射剂。作为体外细胞培养与动物实验用样品。
实施例4将实施例1所提取的薯蓣皂甙先以1，2-丙二醇溶解，然后加入双蒸水稀释，使药物浓度为2.0mg/ml，药液中1，2-丙二醇的终浓度＜30％，过滤除菌，制成注射剂。作为体外细胞培养与动物实验用样品。
权利要求
1.穿山龙及其提取活性成分在制备抗肿瘤药物中应用。
2.根据权利要求1的应用，其特征在于所说的肿瘤包括各种实体瘤和白血病。
3.根据权利要求1的应用，其特征在于所说的肿瘤包括肝癌、肺癌、乳腺癌、胆管癌、胰腺癌、口腔磷状上皮癌等实体瘤和急、慢性白血病。
4.根据权利要求1的应用，其特征在于所说的活性成分是选自下述成分当中的一种或一种以上薯蓣皂甙、薯蓣皂甙元、穿山龙水溶性甙类、穿山龙生物碱盐类、穿山龙黄酮甙类、穿山龙强心甙类。
5.根据权利要求1的应用，所说的穿山龙及其提取的活性成分与其他中药或其他活性成分配伍用于制备抗肿瘤药物。
6.穿山龙及其提取活性成分在制备对抗肿瘤与白血病化疗药物具有增效作用药物中应用。
7.根据权利要求6的应用，其特征在于所说的活性成分是选自下述成分当中的一种或一种以上薯蓣皂甙、薯蓣皂甙元、穿山龙水溶性甙类、穿山龙生物碱盐类、穿山龙黄酮甙类、穿山龙强心甙类。
8.根据权利要求6的应用，其特征在于所说的穿山龙及其活性成分与其他中药或其他活性成分配伍用于制备对抗肿瘤与白血病化疗药物具有增效作用的药物。
全文摘要
本发明涉及中药穿山龙及其提取的活性成分薯蓣皂甙等新用途，具体讲是穿山龙在制备抗肿瘤药物及对抗肿瘤与白血病化学药物具有增效药物中的应用；穿山龙提取的活性成分薯蓣皂甙在制备抗肿瘤药物及对抗肿瘤与白血病化学药物具有增效药物中的应用；穿山龙提取的其他活性成分在制备抗肿瘤药物及对抗肿瘤与白血病化学药物具有增效药物中的应用。
文档编号A61P35/00GK1413608SQ0113676
公开日2003年4月30日 申请日期2001年10月24日 优先权日2001年10月24日
发明者陈信义, 王玉芝, 高智捷, 张开泰, 李冬云, 刘江涛 申请人:北京中医药大学东直门医院