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Western Blotting即免疫印迹实验，用于蛋白质的定性分析，同时能够粗略的估计蛋白质的分子量大小，可谓生物实验的必备技能，传统的Western实验流程包括转膜、一抗杂交、二抗杂交、显色。Western做到绝望的你都遇到了哪些具体问题呢？ 本期内容要帮助大家把Western这个实验的坑填一填，就从转膜开始吧！ 1. PVDF膜和NC膜区别在哪？ 答：通常，PVDF膜蛋白吸附能力强，而NC膜背景更干净；PVDF膜由于疏水等原因，所以使用前需要100%甲醇浸润；NC膜使用方便但比较脆。如果蛋白丰度较低，推荐使用PVDF膜。 2. 膜有多种孔径，该如何选择？ 答：最常用的膜孔径是0.45 μm，适合检测分子量>20kDa的蛋白。0.2 μm 孔径适合检测10-20kDa之间的蛋白。0.1 μm 孔径适合检测<10kDa的蛋白。 3. PVDF膜可以反复杂交么？ 答：对于PVDF膜上的大部分蛋白，在Stripping后重新封闭杂交，仍然能够进行显色出条带。 4. 湿转和半干转如何选择？ 答：半干转时间短速度快，试剂耗费少，但前期需要几次的摸索，且不同的半干转印仪器转印条件相差较多。湿转成功率高，但相对费时，可根据实验条件和个人喜好来选择合适的方案。 5.转膜时需要控制哪些条件？ 答：转膜时需要控制温度，尽量置于冰盒中，利于转膜过程热量的释放，转膜时应注意电流的变化，电流过大应检查缓冲液是否正确。 6.留下几个思考题，我们共同讨论。 a.小伙伴们，转膜缓冲液中甲醇的作用仅仅是为了活化膜么？是否可用其他醇类替代？转大分子时，甲醇的浓度是该增加还是减少呢？ b.蛋白被SDS结合后，抗原表位被占据，那么一抗是如何结合到表位上的呢？ 1. 选择脱脂奶粉还是BSA？ 答：通常，磷酸化蛋白的检测使用BSA进行封闭，普通蛋白脱脂奶粉即可，尽量选择高品质的脱脂奶粉，减少抗体淬灭及非特异条带。 2. 封闭失败案例！ 答：刚参加工作的时候，接到客户电话说显色没条带，一直都在帮客户排查样品和抗体的问题，一直未解决，直到一日翻看客户发过来的图片，发现5%脱脂奶粉的玻璃瓶里微微发绿（其实就是长菌了）。猜想客户是配了一瓶奶粉放冰箱里，随用随取？果不其然，客户说一直都是这样做的啊，以前的蛋白条带都没问题。脱脂奶粉还是现用现配吧！ 1. 一抗选择的时候注意哪些问题？ 答：通常，优先选择单克隆抗体，非特异性条带少。除少量标签抗体外，务必注意物种特异性，尽量选择文献中使用较多的抗体。 2. WB的一抗为何很少有直接带HRP标记的呢？ 答：首先由于一抗生产周期较长，成本较高，利用化学反应标记抗体，损失大量抗体的同时会降低抗体的亲和力，其次样品中目标条带的量较少，所以一抗结合后信号强度较低，显色时条带很弱。反观流式抗体直标较多，标记的荧光基团信号如FITC，PE等，其信号强度大且易于检测。 3.一抗的使用浓度？ 答：一抗的浓度可参考说明书中的稀释比例，但如果实验中发现杂带较多，此时应尝试提高稀释比例，减少非特异性条带。 1. 二抗选择的时候注意哪些问题？ 答：通常，二抗选择首要问题是种属特异性，一抗如果是兔抗，那么二抗可以选择羊抗兔，鼠抗兔等。选择亲缘性较远的种属，能够显著提高特异性。 2. 二抗的主要作用是？ 答：结合一抗的同时，把一抗信号级联放大很多倍，并且二抗上带有HRP等标记，可以进行显色反应。把微弱的信号放大到可供检测的范围内。二抗一般结合在一抗的Fc区，不会竞争性的结合在一抗的V区。 1. 显色液如何使用和保存？ 答：通常将AB液充分混合，使用量一般是按照膜面积进行配置，显色液应避光保存并注意效期。 2. 显色没条带怎么办？ 答：在确定样品，抗体等均无问题后，选择灵敏度高的显色液，fg级别的显色液能够针对低丰度的蛋白进行有效显色。 根据二抗标记的不同可分为酶标二抗和荧光二抗，常见的用于标记二抗的两种酶是HRP辣根过氧化物酶和AP碱性磷酸酶，荧光二抗一般多用Cy3或者Cy5标记。 HRP标记时显色多用ECL试剂，即底物鲁米诺和过氧化氢，HRP催化鲁米诺产生多步氧化反应，使之从基态跃升至激发态并伴随产生428nm的低强度发射光，可以利用CCD或胶片进行检测，ECL检测灵敏度极高，目前多个厂商正在挑战fg级别。另外有小伙伴会问DAB也可用于HRP标记的显色，为什么应用在Western里面很少呢？尽管DAB显色可以产生棕红色的可见条带非常利于观察，但是DAB显色灵敏度较低，对底物的量要求在500pg以上，所以多用于组化显色。还有一种AP碱性磷酸酶标记的二抗多用BCIP/NBT试剂盒进行显色，BCIP在碱性磷酸酶的作用下水解，水解产物和NBT发生反应产生肉眼可见的不溶物，形成有颜色条带，加水后可以终止反应（小编依然清楚的记得第一次做AP显色看到条带时激动的拿着洗瓶挥舞的自我），BCIP/NBT显色灵敏度在100pg左右。这下知道为什么大多的客户都选择ECL显色了吧，毕竟高丰度的蛋白没那么多。 荧光二抗用起来就非常方便了，二抗上直接带标记，所以直接拿去曝光显色，一张膜可以同时杂两个抗体，不用为内参而裁膜的感觉真好。 很多实验者发现显色后，目标蛋白并没有在预测的位置上，反而是落在非常靠上的位置，这是哪些原因造成的呢？小编给出以下原因，小伙伴可以补充； 1. 样品存在强相互作用，或者变性不彻底。 2. 目标蛋白为膜蛋白，样品经过热煮后，发生聚集，针对膜蛋白给出的意见是可以72°进行样品的处理。 |
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