|
前言 奥沙利铂抗性是治疗晚期结直肠癌（CRC）的主要挑战，EMT的获得和癌细胞中抑制的药物积累都有助于奥沙利铂抗性的发展。小的非编码RNA miR-128-3p的异常表达已证明是肿瘤发生和癌症发展的关键调节因子。然而，其在CRC和奥沙利铂抗性进展中的作用在很大程度上是未知的。3月19日山东大学第二医院检验科团队在Molecular Cancer上发表了“Exosome-transmitted miR-128-3p increase chemosensitivity of oxaliplatin-resistant colorectal cancer”，在建立稳定的奥沙利铂抗性CRC细胞系中，体外和体内研究显示miR-128-3p抑制EMT并增加细胞内奥沙利铂积累。重要的是较低的miR-128-3p表达与晚期人CRC患者中较差的奥沙利铂反应相关。此外，数据显示miR-128-3p转染的FHC细胞有效地将miR-128-3p包装到分泌的外泌体中并介导miR-128-3p递送至奥沙利铂抗性细胞，从而改善体外和体内CRC细胞中的奥沙利铂反应。此外，miR-128-3p过表达通过抑制耐药细胞中的Bmi1表达来上调E-钙粘蛋白水平并抑制奥沙利铂诱导的EMT。同时，它还通过抑制药物转运蛋白MRP5的表达降低奥沙利铂流出量。结果表明，通过外泌体递送miR-128-3p代表了通过Bmi1和MRP5的负调节增强CRC中的化学敏感性的新策略。此外，miR-128-3p可能是基于奥沙利铂化疗的有希望的诊断和预后标志物。  研究思路  Figure 1：奥沙利铂耐药的HCT116OxR和HT29OxR细胞经历了EMT并增加了药物外排。 a模型表示获得耐奥沙利铂的CRC细胞的过程。 b母体和抗性细胞系的CCK8测定，然后以指定浓度进行奥沙利铂处理。 c流式细胞术用于奥沙利铂处理的亲本和抗性细胞的凋亡测定。 d HCT116，HCT116-OxR，HT29和HT29OxR细胞的形态。 e通过Transwell测定评估亲本和抗性CRC细胞的迁移和侵袭能力。 f通过伤口愈合测定评估亲本和抗性CRC细胞的运动能力。 gE-cad，N-cad，Vim和Fn在亲本和抗性CRC细胞中的蛋白质印迹分析。 h-i暴露于奥沙利铂处理后，亲代和抗性细胞中Pt的积累及总Pt-DNA加合物水平。 j奥沙利铂暴露后母体和耐药细胞中奥沙利铂诱导γ-H2AX表达的核灶免疫荧光分析。  Figure 2：miR-128-3p在CRC细胞系中的表达及其对奥沙利铂耐药的影响。 a-b进行RT-qPCR测定以检测亲本和抗性CRC细胞中的miR-128-3p表达及用Lv-128和Ctrl转染的HCT116OxR细胞中的miR-128-3p表达。 c用指定浓度的Lv-128转染的HCT116OxR细胞和用奥沙利铂处理的Ctrl的CCK8测定。 d流式细胞术检测转染Lv-128和Ctrl的奥沙利铂治疗HCT116OxR细胞。 e转染Lv-128和Ctrl的HCT116OxR细胞中E-cad，N-cad，Vim和Fn表达的Western印迹分析。 f通过Transwell试验评估转染Lv-128和Ctrl的HCT116OxR细胞的迁移和侵袭能力。 g通过伤口愈合测定评估用Lv-128和Ctrl转染的HCT116OxR细胞的运动能力。 h-i在暴露于奥沙利铂处理后，用Lv-128和Ctrl转染的HCT116OxR细胞中Pt的累积、总Pt-DNA加合物水平以及核灶的γ-H2AX表达的免疫荧光分析。 （k）显示肿瘤体积和代表性生物发光图像.  Figure 3：miR-128-3p的表达水平与CRC患者中奥沙利铂治疗反应相关. a RT-qPCR分析来自健康供体和治疗初始的患者的CRC组织中的miR-128-3p，受益于新辅助奥沙利铂治疗并且在奥沙利铂治疗期间复发。 b在奥沙利铂治疗期间，非PD或PD的CRC患者的治疗前组织中miR-128-3p的RT-qPCR分析。 c通过AUC评估的使用miR-128-3p检测奥沙利铂的ROC曲线。有或没有奥沙利铂治疗的CRC患者PFS的Kaplan-Meier生存曲线分析。 d所有患者;即miR-128-3p表达低的患者. F miR-128-3p表达高的患者。  Figure 4：来自miR-128-3p转染的FHC细胞的外泌体的表征和作用。 aTEM分析外泌体，其显示相同的形态。NTA分析了来自FHC细胞的外泌体的大小分布和数量。 b蛋白质印迹分析显示外泌体富集的培养基，其具有CD63和CD9的外泌体标记物的表达以及顺式-高尔基体基质蛋白的非表达。 cRT-qPCR检测来自用Lv-128和Ctrl转染的FHC细胞的外泌体中的miR-128-3p表达。 d用RNase A和/或Triton X-100处理128-exo共培养细胞中miR-128-3p的RT-qPCR分析，然后进一步与RNase抑制剂混合。 e来自FHC-128细胞的外泌体的内化。 f用PBS，NC-exo，128-exo，128-exo处理的受体HCT116OxR细胞中的miR-128-3p的RT-qPCR分析。 g在128-exo的不同孵育时间共培养的受体HCT116OxR细胞中miR-128-3p的RT-qPCR分析。 h用放线菌素D处理的HCT116OxR细胞中miR-128-3p的RT-qPCR分析，然后128-exo处理。  Figure 5：通过128-Exo细胞间转移miR-128-3p使CRC细胞对奥沙利铂试剂敏感。 a用指定因子预温育的HCT116OxR细胞的CCK8测定，然后以指定浓度进行奥沙利铂处理。 b用于凋亡测定的HCT116OxR细胞的流式细胞术。 c用指定因子孵育后HCT116OxR细胞中蛋白质E-cad，N-cad，Vim和Fn表达的Western印迹分析。 d通过Transwell测定评估用指定因子孵育后HCT116OxR细胞的迁移和侵袭能力。 e通过伤口愈合测定法测定HCT116OxR细胞在用指定因子孵育后的运动能力。 f-g在暴露于奥沙利铂处理后，与指定因子一起孵育后，HCT116OxR细胞中Pt的累积及总Pt-DNA加合物水平。 h针对γ-H2AX表达的核灶的免疫荧光分析将HCT116OxR细胞与指定因子一起孵育，然后暴露奥沙利铂。 i在裸鼠中用载体或奥沙利铂处理的裸鼠中瘤内注射PBS，128-exo和exo/FHC miR-128-3p电极对裸鼠中的HCT116OxR细胞进行皮下异种移植测定。（i）显示肿瘤体积。（j）代表性生物发光图像.  Figure 6：含有miR-128-3p的外泌体通过靶向Bmi1和MRP5使CRC细胞对奥沙利铂敏感。 aBmi1和MRP5 mRNA 3'-UTR区域中推定的预测的miR-128-3p结合位点。 b-cSpearman对CRC组织中Bmi1 mRNA、MRP5 mRNA与miR-128-3p的相关性分析。 d在不同条件下对Lv-128转染的HCT116OxR细胞进行CCK8测定。 e流式细胞仪检测Lv-128转染的HCT116OxR细胞在不同条件下的细胞凋亡。 f蛋白质印迹分析Lv-128转染的HCT11 6OxR细胞在不同条件下的蛋白质Bmi1，E-cad，N-cad，Vim和Fn表达。通过Transwell测定评估Lv-128转染的HCT11 6OxR细胞在不同条件下的迁移和侵袭能力。 h通过伤口愈合测定法测定Lv-128转染的HCT11 6OxR细胞在不同条件下的运动能力。 i蛋白质印迹分析Lv-128转染的HCT116OxR细胞在不同条件下的蛋白质MRP5表达。 j-k暴露于奥沙利铂处理后，在不同条件下Lv-128转染的HCT116OxR细胞中Pt的积累和总Pt-DNA加合物水平。 l 奥沙利铂暴露后，不同条件下Lv-128转染的HCT116OxR细胞的γ-H2AX表达的核灶的免疫荧光分析。 m用指定因子孵育后HCT116OxR细胞中蛋白质Bmi1和MRP5表达的蛋白质印迹分析。 n瘤内注射NC-exo和128-exo对异种移植瘤组织中Bmi1和MRP5蛋白水平的免疫组织化学分析。 结论 目前，产生奥沙利铂抗性的晚期CRC患者具有有限的治疗选择。因此，有必要研究奥沙利铂耐药的生物学基础，并确定新的治疗靶点和奥沙利铂耐药的预防策略。该研究将miR-128-3p鉴定为重要的抗肿瘤microRNA和肿瘤进展抑制剂。miR-128-3p在奥沙利铂抗性CRC中下调，并且在功能上需要抑制耐药表型。miR-128-3p过表达通过竞争性结合Bmi1和MRP5 mRNA 3'-UTR重新敏化奥沙利铂反应，导致奥沙利铂抗性CRC细胞的间充质-上皮转变和减少的细胞奥沙利铂流出。还展示了一种新的策略，即使用外泌体将治疗性miR-128-3p转移到抗性CRC细胞中来增加CRC化学敏感性。miR-128-3p修饰的FHC细胞有效地将miR-128-3p包装到分泌的外泌体中，并介导miR-128-3p转移至耐奥沙利铂的CRC细胞。因此，通过改变Bmi1和MRP5表达使抗性CRC细胞对化学治疗剂更敏感。  基于miR-128-3p的外显子信号通路在CRC治疗中示意图。在奥沙利铂耐药的CRC细胞中，来自FHC-128细胞的外泌体miR-128-3p通过竞争性结合Bmi1和MRP5逆转奥沙利铂抗性，导致E-钙粘蛋白表达增加并减少奥沙利铂外排。 Mir-128被描述为肿瘤抑制因子，并且在胶质母细胞瘤中首次发现miR-128水平降低。最近研究表明，在一些恶性癌细胞表型中观察到异常的miR-128-3p表达。文章通过强调miR-128-3p在化疗耐药CRC中的作用来扩展当前的知识。结果表明，CRC肿瘤组织和细胞系中的miR-128-3p表达水平显着低于正常组织和细胞系。另外，与敏感细胞相比，在奥沙利铂抗性细胞中鉴定出下调的miR-128-3p。因此，推测miR-128-3p可能在奥沙利铂抗性CRC中起重要作用。 了解CRC中的耐药机制对于优化当前的治疗策略至关重要，通过关注可能的分子靶标探索了miR-128-3p介导的化学抗性逆转的潜在机制。文章确定polycomb组蛋白Bmi1作为miR-128-3p的功能靶标来调节EMT。在之前的研究中，Bmi1在CRC中高表达，是诊断和预后的潜在生物标志物。与Bmi1在头部和颈部鳞状细胞癌中通过抑制E-钙粘蛋白表达的Twist1诱导的上皮-间质转化中必需的观察结果一致，研究发现miR-128-3p正调节E-cadherin的表达。因此，由于miR-128-3p减少导致的Bmi1过表达可能通过该途径导致CRC中的化疗诱导的EMT。 此外，发现作为ABC转运蛋白家族成员的MRP5也是miR-128-3p的靶标。人类ABC基因编码ATP依赖性转运蛋白，可以在生物膜（细胞和囊泡）的两个方向上移动底物，抵抗其电化学梯度。研究结果表明，高表达的miR-128-3p通过下调癌细胞中的MRP5表达来减少奥沙利铂的输出。此外，降低的奥沙利铂流出可导致更高的组织分布和细胞内药物定位，从而形成最终破坏肿瘤细胞的破坏性DNA-铂加合物。简而言之，结果表明与亲本细胞相比，在奥沙利铂抗性细胞中miR-128-3p表达显着下调。miR-128-3p的过表达可以通过减少与奥沙利铂抗性相关的Bmi1和MRP5表达来重建抗性细胞的敏感性。在体外和体内，奥沙利铂联合miR-128-3p过表达比单独的奥沙利铂更有效地抑制抗性CRC细胞的发展。 将外源性合成siRNA与miRNA进行对比是非常重要的，miRNA是正常细胞中的内源性分子，具有可能较少的意外脱靶沉默效应。由于microRNA分子靶向一组编码基因而不是单一基因，因此基于microRNA干扰的治疗可能通过靶向多种分子途径在癌症治疗中更有效。外泌体具有保护细胞内容的能力，如miRNA免于循环中的降解，并作为携带者将其供体细胞的内容传递给受体细胞。虽然脂质体也可能比基于病毒的递送系统提供治疗性分子递送的优势，但它们表现出低效率和从循环中快速清除。与脂质体不同，外泌体含有膜锚定和跨膜蛋白，可在功能上增强内吞作用，从而促进其内部物质的传递。 外泌体蛋白，如CD47，可以逃避循环单核细胞的吞噬作用，并增加外循环中外泌体的半衰期。此外，最近的证据表明，与脂质体相比，外泌体表现出更高的“药物”传递能力并抑制肿瘤生长。此外，当在体内使用合成纳米粒子时，使用外泌体也可以最小化细胞毒性。同时，由于它们的纳米尺寸，外泌体被作为用于探索开发新治疗应用的纳米装置。 本研究展示了一种通过128-exo介导的治疗性miR-128-3p转移来增加CRC化学敏感性的新策略。研究表明来自miR-128-3p过表达FHC的外泌体可以在体外和体内将miR-128-3p递送到耐奥沙利铂的CRC细胞中，通过改变靶基因Bmi1和bmi1的表达进一步恢复CRC细胞对化学治疗剂的敏感性。因此，通过降低靶基因的表达，来自miR-128-3p修饰的FHC的外泌体可以通过抑制EMT和药物的外排有效地增加CRC细胞的化学敏感性。鉴于奥沙利铂的全身治疗是晚期CRC的标准治疗，进一步测试了128-exo是否可以在小鼠模型中发挥其抑制功能。使用比临床量更低浓度的奥沙利铂来治疗CRC异种移植肿瘤，免疫组织化学分析结果表明，128-exo的肿瘤内注射通过降低Bmi1和MRP5的表达，在较低的奥沙利铂浓度下显着增强肿瘤抑制。另外，体外实验表明128-exo处理随着时间的推移减少了CRC细胞中的基因表达，直至128-exo处理。 本研究结果表明，miR-128-3p不仅可作为奥沙利铂反应的临床生物标志物，还可作为治疗靶点。通过外泌体递送miR-128-3p增加了CRC细胞对奥沙利铂的敏感性，从而为CRC提供了新的治疗策略。 全文链接 https://pan.baidu.com/s/1wupL0vr6i9voHdkFnuOQZg 提取码: mpb9 EVs-Exosomes由苏大，浙大, 法国居里研究所数位博士、博后及教授创建。 |
|
|
