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上回(2020年国自然准备：CRISPR技术的新应用──技术进步与科研工具)末尾，提出了三个问题：1. RNAi与CRISPRi的区别与选择;2. CRISPR/Cas9基因删除的优点;3. CRISPRa与过表达的区别与选择。今天我们来阐述其中的第一个问题：RNAi还是CRISPRi。 Park Guell RNAi和CRISPRi的区别 首先是靶标不同：RNAi的靶标是RNA，而CRISPRi的靶标是DNA的转录起始位点(transcription start site, TSS)。 我们讲述过RNAi的实现机制（原文链接：RNAi）：将一小段siRNA导入细胞，siRNA招募蛋白形成RISC复合物，则降解此siRNA配对的mRNA。因此，靶mRNA和后续的靶蛋白可以在转录后水平上被减少。 而CRISPRi，其实现机制是，将一小段sgRNA和dCas9（或融合KRAB）基因（或mRNA，或蛋白）导入细胞，sgRNA招募dCas9蛋白，并引导dCas9蛋白靶向结合该基因的启动子区域的DNA。则该位置被dCas9“占据”，基因转录被抑制。 第二个区别是，实现的场所不同：一般情况下，RNAi发生在胞质内，而CRISPRi的实现场所是在核内。 因为，RNAi实现机制的这些组份，似乎只有细胞质中有高度活性。转录得到的RNA，出核后在细胞质内被RNAi降解。在核内转录产物，如lncRNA(长链非编码RNA)，则无法被高效地降解。因此，用RNAi在转录后水平敲降lncRNA，可能无法得到“功能缺失研究”的表型。 CRISPRi作用于DNA，直接抑制转录起始，可在核内进行。 因此，在effector RNA是相同量的情况下，CRISPRi似乎比RNAi的作用要强劲，且更持续。例如，Gilbert等在2014年的工作【1】显示，CRISPRi基本能达到90-99％的敲降水平。 此时，CRISPRi技术是优于RNAi的。 第三个区别是，脱靶率不同：RNAi似乎更高一些，而CRISPRi更低。 RNAi中，siRNA可能会与非靶mRNA的3’UTR相互作用，导致其降解。一条siRNA可能会降解数百条转录产物。另外，RNAi用了in vivo的天然通路来实现机制：RISC复合物内原本是内源的microRNA，转入胞内的人工siRNA将RISC复合物内的microRNA置换出来。这可能会影响microRNA的功能，进而转录水平的变化，造成脱靶效应。 CRISPRi中，dCas9也可能结合至非靶点部位。然而，dCas9行使功能需要结合在TSS处的一小段DNA上，因此，dCas9结合至非靶点部位也不必然抑制转录。另一种观点认为，dCas9融合的KRAB结构域，能使结合部位异染色质化，可能会导致结合位点转录抑制。然而Gilbert等在2014年的工作中，采用大量的阴性参考品sgRNA进行了CRISPRi的筛选，发现它们几乎没有抗增殖作用，因此CRISPRi的脱靶效应不是主要问题。 此时，CRISPRi技术是优于RNAi的。 第四个区别是，实验操作不同。 对几乎所有的哺乳动物细胞，RNAi操作，只需导入一小段siRNA(shRNA)即可实现。而CRISPRi，需导入sgRNA和Cas9。因此，RNAi操作要稍简易些。 综上，RNAi和CRISPRi各有特点，所以，在选择时还是主要看靶点是什么，及敲降的要求。一般而言，CRISPRi操作会带来更显著的表型。 2 Casa Batlló 案例解析 下面来看一个案例，凸显了CRISPRi相对RNAi的更高敲降效率：2018年清华大学生命科学联合中心姚骏课题组和中科院北京基因组所米双利课题组合作，在Nature Neuroscience发表了文章“CRISPR interference-based specific and efficient gene inactivation in the brain”【2】。文章报道了他们建立的在动物脑内进行基于CRISPRi的多重基因条件性敲降平台。 在这项研究中，研究人员利用病毒，将CRISPRi系统(含dCas9-KRAB，KRAB是著名的转录抑制因子)注射入小鼠脑内。从小鼠神经元中的结果，我们可以一窥CRISPRi的优点： 1、CRISPRi在基因沉默水平上显著优于传统的RNAi技术。如下图，mRNA水平和蛋白水平检测结果都如此：   2、用ChIP证明CRISPRi具有精确的靶向特异性，即dCas9-KRAB与Syt1 locus特异性结合。如下图，将sgRNA突变后，发现dCas9-KRAB不结合Syt1 locus：  3、可进行条件性CRISPRi，即在dCas9-KRAB前加一个条件性启动子。如下图，可控制dCas9-KRAB在特定类型神经元表达：  4、可同时进行多重基因的CRISPRi，将若干sgRNA、启动子，和dCas9-KRAB串联表达；或者仅串联sgRNA，与dCas9-KRAB一起，用慢病毒包装后导入小鼠。都可得到不弱于单个sgRNA的敲降结果。如下图，左为慢病毒载体示意图，右为不同组合中mRNA的表达量：  讲了这么多，CRISPRi还是好处多多哦！当然，RNAi用了这么多年，功能也很强大。那么，除了效率上的考虑。对这两者的选择还有其它考虑吗？我们在下一回，继续通过文献，来介绍下CRISPR技术的独特应用。 伯豪生物提供上述的RNAi、CRISPR/Cas9基因删除、CRISPRi服务。 参考文献： 1，Gilbert LA et al. Genome-Scale CRISPR-Mediated Control of Gene Repression and Activation. Cell. 2014 2，Yi Zheng et al. CRISPR interference-based specific and efficient gene inactivation in the brain. Nature Nueroscience. 2018 3 Casa Milà   作者：招财猫 |
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