技术详解 | RIP-seq如何准确锁定目的蛋白结合的RNA？

RIP-seq研究的是什么？ 

RIP-seq（RNA免疫沉淀结合高通量测序）是研究RNA结合蛋白的一种技术，可获得RNA结合蛋白结合（调控）的RNA，以及结合的位置、结合基序，结合强度等信息。

RIP-seq使用目的蛋白特异性抗体与样本孵育，使抗体与目的蛋白结合，然后磁性分离抗体及其结合的目的蛋白，目的蛋白结合的RNA也一并被分离出来，这样我们就获得了目的蛋白和它结合的RNA片段。

RNA片段洗脱、建库、测序，便知目的蛋白结合哪些RNA，结合强度、结合位置、结合基序等丰富的信息，进而还能进行差异结合分析、GO富集分析、KEGG通路富集分析。

 1. RNA免疫沉淀获取目的蛋白 

RIP和ChIP的流程类似。我们会首先裂解细胞，释放细胞内所有物质。为了保证免疫沉淀的特异性和效率，我们需要将细胞裂解产物分为几份，设置对照。

第一份我们不进行后续免疫沉淀（IP），作为初始对照（或阳性对照）用于了解样本IP前的情况；

第二份进行IP，即使用特异性抗体富集目的蛋白；

第三份同样进行IP，但是不使用特异性抗体，而是使用IgG进行IP。

 免疫沉淀后，一方面，要对富集的蛋白进行WB质检，检测IP的特异性和目的蛋白的富集效果。

另一方面，还要提取RNA进行定量、构建测序文库，并对文库质检。

 WB质检结果：

1. 如果目的蛋白在样品中有表达、抗体效果较好，在样品中可以检测到目的蛋白，Input在对应位置产生条带；

2. 如果使用的抗体能有效富集目的蛋白，那么IP也会在对应位置产生条带；此外还会出现抗体的条带，这是由于抗体与蛋白紧密结合，上样前无法分离，WB质检时加入的酶标二抗结合抗体重链（或轻链）在55kD（或25kD）出现条带。

3. IgG可帮助我们判断免疫沉淀体系是否对蛋白有非特异性结合或，特异性高的RIP结果应该是无目的条带，仅有IgG的重链（或轻链）条带。

IP与Input比较可判断IP效率（是否有效富集），IgG做阴性对照可判断IP的特异性（是否为特异性富集）。经过这些对照层层把关，RIP实验、RIP-seq的结果才能更有保障、更加高质、可靠。

WB质检结果展示

文库质检结果展示

  2. Peak Calling锁定目的蛋白结合的RNA 

IP富集的RNA就是目的蛋白结合的RNA了？

并不是，或者说并不完全是。

RIP确实会对目的蛋白结合RNA产生富集，那么在参考基因组上、蛋白结合的区域，测序reads的覆盖度升高，相对其他区域形成明显的“峰”。

但是由于RNA表达量本身存在差异，扩增、测序过程又引入偏好，非富集区域的reads覆盖也可能存在高高低低的“峰”，这无疑对筛选结合峰（Peak calling）产生严重干扰。

我们来举个例子：样本中有A mRNA共10条，均被目的蛋白结合，且都被IP下来，样本中还有B mRNA共 100条，其中只有10条被目的蛋白结合，也都被IP下来。目的蛋白对A、B mRNA的结合数目一样，但结合比例明显有天壤之别。这时我们再评判目的蛋白对A、B mRNA的结合，就需要考虑A、B mRNA表达的差异了。

Peak calling时我们会对比input和IP归一化后的reads平均覆盖深度，将input作为背景，进行Peak calling，将input产生的背景“峰”过滤，避免RNA表达等背景因素产生假阳性结果。

如上图所示，IP的reads在蓝色区域和灰色区域的分布较为相似，input的reads数则有较大差异。在蓝色区域，我们通过对比IP和input可以筛选出Peak；但是在灰色区域，因input本身有峰，对比IP和input后发现无法筛选到正真的Peak。

 3. 数字标签UMI还原RNA原始丰度 

其实，康测科技在建库时还留了一手，给文库片段都标记了数字标签（UMI）。

RNA结合蛋白对RNA序列是有选择性的，会倾向于结合具有某些特征的序列，因此RIP测序文库碱基平衡性通常不佳，PCR扩增偏好会导致比转录组测序更为严重的测序偏差，因此，UMI的使用也更加必要。

数据分析前，我们先根据数字标签追溯reads来源，同一个片段经过PCR扩增的产物均带有同一UMI，我们根据UMI便能精确追踪reads的来源，对那些由于PCR扩增偏好等种种原因产生的异常扩增的reads归类和去重，再以真实的序列丰度进行Peak calling，达到绝对定量检测。

做到这些，我们才算真正准确锁定了目的蛋白结合的RNA。