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CRISPR技术可以在基因组水平对目标基因进行激活上调、转录抑制以及缺失。那到底该选择哪种类型进行研究呢？使用CRISPR-Cas9技术需要考虑哪些问题？今天在这里给出几点建议供大家参考。 一、 选择合适的基因功能研究技术 Activation，repression或者deletion到底该选择哪个？ 以lncRNAs为例，如果研究的lncRNAs在选择的细胞模型中是有表达的，那CRISPR-del和CRISPRi两种基因功能缺失(LOF)策略是不错的选择。但是通常情况下没有研究能够告知哪种技术对于lncRNAs的研究更加有效。CRISPRi只需要构建1个sgRNA，而CRISPR-del则需要构建至少两个sgRNA。 而当研究的lncRNAs在选择的细胞模型中不表达时，CRISPRa功能获得(GOF)策略就成为非常有效的方法。从治疗角度来看这个问题，功能缺失(LOF)策略优于功能获得功能获得(GOF)策略，原因是已经有很多ASO 功能抑制药物，其原理也是功能缺失(LOF)。理想情况下，具体实验应该使用多种不同技术来确保实验结果的敏感性和准确性。 二、文库选择与设计 到底是选择全基因组文库还是亚文库？这个与具体的实验以及要验证的功能有关。 那文库基因覆盖的范围又如何确定呢？最理想的情况是，选择的文库能覆盖细胞模型中表达的所有基因。但这点很难做到，特别是lncRNAs。原因是lncRNAs的注释信息不够全面详细。这时有两种选择方案：一是选择已有的文库，但是可能与研究选择的细胞模型不能完美匹配；二是选择定制新的文库。 定制文库设计的三个步骤：（1）候选基因的确定；（2）确定转录起始位点；（3）sgRNA的设计，将脱靶效率降到最低水平。 三、细胞模型选择 细胞系的选择需要与研究的癌症疾病匹配，基因组数据完整全面比如RNA-seq，CAGE和组蛋白修饰数据。细胞模型的选择可以参考目前比较权威的两个数据库：ENCODE 和Cancer Cell Atlas。 四、数据分析 CRISPR筛选技术的最后一步就是通过对比Pheno+ 组和Pheno- 组，从NGS数据中鉴定出命中基因。有多种数据统计分析算法可以选择：MAGeCK/ENCoRE、Bayesian analysis (BAGEL)、STARS，只是不同的统计算法对数据的要求不同。 五、其他考虑 表型分析：CRISPR技术可以与目前已经建立的基于细胞的不同表型分析方法结合，从简单的增殖实验到复杂的耐药性、迁移和标志物基因表达实验。 实验数据：任何研究都必须由完整的实验记录和实验数据组成，在使用CRISPR进行研究时，关键参数必须受到监控和控制，以确保最终结果的准确性。要求保证整个实验数据的完整性，至少两次的生物学重复。 希望上述的几点建议能够对有兴趣使用或计划使用CRISPR/Cas9 技术进行研究的朋友们带来帮助。接下来分享四篇使用CRISPR/Cas9 技术发表的高分文章。 高分文章分享 1.Synthetic Lethality of Wnt Pathway Activation and Asparaginase in Drug-Resistant Acute Leukemias  这篇文章有望为“最难治的”白血病带来治疗新思路。 文章利用CRISPR基因编辑技术，使用张峰GeCKO v2 human library (Addgene#1000000048 and 1000000049) 在耐药的白血病癌细胞中做了全基因组的筛选，寻找对癌细胞生存至关重要的基因。文章发现了Wnt通路的激活会诱导门冬酰胺酶的敏感性，揭示了一种门冬酰胺酶治疗与激活稳定性依赖于Wnt的蛋白质组的合成致死（Synthetic lethality）策略，通过减少GSK3依赖蛋白的降解来限制天冬酰胺在细胞中的含量，也就是说如果能设计出一种抑制GSK3的药物，就有望杀死那些对天冬酰胺酶治疗产生耐受的癌细胞。 所谓合成致死（Synthetic lethality）是指两个非致死基因同时失活导致细胞死亡的现象。合成致死筛选可以使用很多方法，如：小分子，RNAi，CRISPR-Cas9技术。而现在CRISPR-Cas9技术成为目前进行合成致死筛选的主流技术，其优势为CRISPR-Cas9技术是在DNA水平发生作用，基因的功能缺失相比RNAi更为彻底。 2.Hacking the Cancer Genome: Profiling Therapeutically Actionable Long Non-coding RNAs Using CRISPR-Cas9 Screening  近年来随着Long non-coding RNAs (lncRNAs)研究的迅猛发展，lncRNAs作为潜在的癌症靶标库，传统的RNAi技术已经无法满足lncRNAs功能的研究。但是CRISPR-Cas9基因组编辑技术可以实现在高通量和低成本的前提下对lncRNAs进行功能性筛选。 这篇综述旨在阐明CRISPR-Cas9基因组编辑技术在发现onco-lncRNAs的潜力，同时能够指导那些希望将CRISPR-Cas9技术应用于癌症研究的分子肿瘤学家。文章使用CRISPRdel，CRISPRi，CRISPRa技术对lncRNAs的功能进行研究。 lncRNA的特点：长度在200–10,000 nt；没有编码蛋白质的潜能；表达量低，具有高细胞组织类型特异性；定位多样化，存在与细胞核，核质，胞浆等。由于lncRNA具有的特性，RNAi技术已经不是一种研究lncRNA功能的有效策略，CRISPR-Cas9技术作为一种基因组编辑技术，可以操作基因组的任何元件，可以针对启动子，内含子，外显子进行操作。更为重要的是，CRISPR-Cas9技术可以克服RNAi等方法的缺点，同时能够有效的对lncRNA进行研究。 3.Targeting an RNA-Binding Protein Network in Acute Myeloid Leukemia  转录和翻译失调在癌症中是经常发生的，而RNA结合蛋白(RNA-binding proteins ,RBPs)作为关键调节器对于癌症的转录和翻译失调的调节有重要作用。 文章通过利用CRISPR-Cas9筛选技术对490个经典的RBPs的RNA结合结构域进行功能缺失（LOF）研究，揭示出AML中被上调的RBPs的互作网络，同时发现RBPs对RNA的剪切和AML 存活率非常关键。通过CRISPR-Cas9筛选技术阐明在RBPs互作网络中RBM39是一个中心目标分子，为AML的治疗提供了策略。 RNA结合蛋白(RNA-binding proteins ,RBPs)是一类含有独特RNA结合结构域（RBDs）的多样化蛋白质。经典的RBPs都包含一个或多个保守的RBDs，这些RBDs包括但不限于RNA识别基序（RRM），K-同源（KH）结构域和DEAD-box结构域，其已在结构和生物化学上被广泛确定。 4.Small-Molecule Agonists of Ae. aegypti Neuropeptide Y Receptor Block Mosquito Biting  神经肽Y（neuropeptide Y，NPY）是一种广泛存在于中枢和外周并维持内环境稳态的激素。在中枢，NPY有抗焦虑抗癫痫功能，并且具有抑制生殖、抑制肌肉兴奋、抑制交感兴奋的作用，导致人体的血压、心率、代谢下降， 它还能够促进食欲，并因此成为节食药物的靶点。 埃及伊蚊非常喜欢叮咬人类，因为人类的血液中含有母蚊子产卵需要的蛋白质。但是值得注意的是，当它们叮咬一次之后，他们对人类血液失去兴趣，也就是不再叮咬人类，持续时间长达数日。这究竟是什么机制在起作用呢？文章有效利用NPY的功能，运用CRISPR-Cas9技术对蚊子身上的49种可能的神经肽受体进行功能缺失(LOF)研究筛选，鉴定出NPY-like receptor 7 (NPYLR7)，文章研究结果对未来的进一步研究和病媒控制都有深远的影响。 结 语 CRISPR文库是用于遗传筛选试验的一个非常有用的工具，其相对容易的sgRNA设计和可以对几乎任何基因座进行修饰的两大优点使其明显优于其他技术如RNAi。 上期文章中介绍了发表在Nature的《Prioritization of cancer therapeutic targets using CRISPR–Cas9 screens》。该文章得益于CRISPR文库筛选技术敲掉了横跨30个癌种的324种癌细胞系中的18,009个基因，同时利用其开发的基因评分系统对600个最有希望的药物开发靶点进行排序，找出了致癌关键基因。正如文章作者Kosuke Yusa表示：CRISPR是一个非常强大的工具，五年之前无论如何也做不到今天这样的规模和精度。今天的CRISPR基因编辑技术给他们提供了一个绝佳的机会去开发抗癌新药。我们相信以后利用CRISPR技术研发的抗癌药物会越来越多，这也将会给人类最终攻克癌症带来更多的希望。 |
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