【原】经穴的微观形态---小凹的生物学结构与功能 节选十五

       笔者把小凹认定为穴位的微观形态，是因为从小凹分布上：3种小凹蛋白在经络物态－-平滑肌细胞上均有分布；从构成组分上：小凹胆固醇含量的增减，会导致小凹数的变动及穴位的多样性；从细胞信号贮存上：小凹是Ca^2＋及细胞信号转导的富集区。下面见小凹微观形态的具体分析。

⒈ 小凹的含义与结构

       Caveolae，称小凹，也称小窝、微囊、胞膜窖，是细胞膜表面特化的内陷囊泡。直径50～100nm，一般呈烧瓶状或Ω形，也有的呈管形、扁平形、囊泡形等。这些小凹可单独存在，也可由多个融合成长管形或葡萄串状。它们在细胞表面呈开放或者关闭的状态，以便产生胞吐或胞吞作用。小凹主要由蛋白质和脂类组成，其中蛋白质包括小凹蛋白、脂质锚定蛋白，脂类包括胆固醇、鞘磷脂、鞘糖脂等^{［16，p1919］}。

1953年美国Palade首次发现Caveolae，1955年日本Yamada发现类似结构，将这种囊泡称为Caveolae ，意为拉丁语小洞^{［17，p148］}。

       小凹组成中的小凹蛋白，即为Caveolin，它是Caveolae 的表面标记功能蛋白，具有脚手架样结构。到目前为止,已发现Caveolin家族有Caveolin-1 (Cav-1)、Caveolin-2 (Cav-2)、Caveolin-3(Cav-3) 三个成员，其中Cav-1有Cav-1α、Cav-1β两种异构体；Cav-2有Cav-2α、Cav-2β、Cav-2γ三种单体；Cav-1和Cav-2 广泛分布于内皮细胞、平滑肌细胞、上皮细胞及成纤维细胞中，组织分布相似；Cav-3主要分布在肌肉细胞,其中平滑肌细胞则能表达Caveolin-1、-2、-3三种小凹蛋白^{［18，p216］}。

⒉ 小凹增减因素

⑴ 胆固醇含量变动对小凹的影响     胆固醇是小凹主要构成组分，Cav-1与胆固醇亲和力极强， Cav-1运输胆固醇的速度较其它运输机制快4倍多，从而将细胞内新生的胆固醇能迅速从内质网运向细胞膜，被输送的胆固醇参与形成小凹、构成细胞膜或与高密度脂蛋白汇合。同时Cav-1也可帮细胞内多余的胆固醇及时清除，维持脂类稳态^{［17，p148］}。

小凹胆固醇是高含量，90%的细胞内游离胆固醇在细胞膜,而小凹的胆固醇含量又远高于胞膜上其它部位。当小凹中的胆固醇含量降低,其结构将变扁平, 小凹数量也随之减少, Caveolae的胞饮作用也被明显抑制。如果小凹的胆固醇被耗竭,可导致下调Cav-1和mRNA的表达水平^{［18，p219］}。

⑵ 血管平滑肌细胞异况也会引起小凹的增减     许多研究表明，小凹是游离胆固醇（FC）储运和流出的主要部位或“洗涤池”。正常情况下，血管平滑肌细胞和内皮细胞都存在一定数量的小凹，如果出现病情(如高胆固醇血症等)，会引起细胞表面小凹数量的增加。据Thyberg等报道，血管平滑肌细胞处于收缩型时含有较多小凹。当收缩型转变为合成型时．小凹会减少或丢失，其主要原因是小凹蛋白穿梭转运功能被限制，Fc在细胞内被酯化并最终导致泡沫细胞形成^{［19，p274］}。

⒊ 小凹是Ca^2＋及信号转导的富集区 

⑴ 小凹是Ca²⁺的储存库     研究证实, 参与运输Ca²⁺的关键分子如IP₃受体、钙泵和CaM均聚集在小凹内。以及内皮细胞上受Ca²⁺流精密调控的关键信号分子内皮-氧化氮合酶(eNOS)也聚集于小凹，小凹成为Ca²⁺的储存库和出入口^{［20，p101］}。

许多不同的钙通道存在细胞膜上，钙进入细胞的位点要经过小凹，小凹含有钙信号必需的一些分子。Ca²⁺通过组成蛋白中的相当一部分位于小凹，它们能和其它的钙信号蛋白组成多蛋白复合体^{［21，p11］}。

启用免疫组织化学和免疫荧光显微技术可观察到，钙泵呈线性分布于细胞边缘的小凹小区，L型钙通道、质膜钙泵以及钙网织蛋白和肌集钙蛋白都存在于富含小凹蛋白的质膜上。

在平滑肌中，caveolae控制着局部肌质网钙离子释放的形成，因此起着触发钙火花(Ca²⁺)的作用。小凹含有二氢吡啶敏感的Ca²⁺通道，是产生钙火花必需的结构元件。若用甲基-β-环糊精耗竭小凹，则发现呈剂量依赖性地降低了钙火花的振幅和频率。如果小凹的分子组成或超微结构受到改变，可能Ca²⁺信号的病理生理学会引起变化。钙火花是由多个RyRs通道触发的，小凹遭到破坏将会增加小凹Ca²⁺通道与RyRs的距离扩散，导致RyRs的数目减少，钙火花的幅度、频率等也随之降低^{［22，p408-9］}。

⑵ 小凹是信号转导中心    小凹是脂筏的一种类型，而脂筏是指膜脂双层内含有特殊脂质及蛋白质的微区，由微区内陷形成的囊泡称为小凹（caveolae）。小凹能成为信号转导中心，其源自小凹、源自脂筏的结构特点。

穆攀伟等^{［23，p480］}获悉：小凹蛋白(caveolin)上有跨膜、寡聚化和脚手架三个结构域，其中跨膜结构域由三部分组成，N端和C端为亲水性氨基酸，中间为疏水性氨基酸，这样形成发夹样结构，中间插入膜内，两端则位于胞浆中, 这样膜外信号将有助于传至膜内。

对于脚手架结构域(CSD)一般认为：位于小凹蛋白-1的82—101残基和小凹蛋白-3的55-74残基，其氨基酸序列是φXφXXXXφ或φXXXXφXXφ(X代表任何氨基酸残基，φ代表芳香族氨基酸残基)。该序列存在于众多信号分子中、为许多信号分子的共同序列。这一序列均位于信号分子的催化活性区，并且明确了这一序列是小凹蛋白和信号分子结合而发挥调节作用的部位。

孙东明等^{［24，p245-7］}关于小凹在细胞信号转导中的作用研究认为：小凹蛋白能直接与多种信号分子如：G蛋白α亚单位、胰岛素受体、Src酪氨酸激酶家族成员(Src,Fyn等)、Ha-Ras、eNOS、EGF受体、 PKC等连接,从而调控这些信号分子的活性状态。这一段序列如同形成的脚手架,可在其上连接多种信号分子,所以称之为“脚手架区”。

许多信号分子有相似的小凹蛋白连接域,这些信号分子在小凹内富集,细胞的许多信号转导途径在小凹发生交联, 小凹成为细胞信号转导的枢纽。其信号转导枢纽表现在：

①G蛋白介导的信号转导：  多数小凹膜中都发现有G蛋白,其含量明显高于其它质膜区。Shengwen等发现小凹蛋白能与G蛋白(Go,Gi，Gs)的α亚单位直接结合。G蛋白偶联受体（GPCR）如缓激肽、β-肾上腺素能受体、内皮素、乙酰胆碱等主要位于小凹上。承前所述,G蛋白、GPCR、G蛋白的下游分子集中于小凹,便于G蛋白介导的信号转导。

②蛋白激酶C(PKC)：  研究证实了小凹作为激活的PKC和它们的靶底物聚集之处,致使ERK激活的磷酸化级联反应的发生,而小凹蛋白与PKC酶活性部位直接结合,对酶活性产生负性调控作用。

③酪氨酸激酶的级联反应： 小凹富含受体型和非受体型的酪氨酸激酶。Li等发现，小凹蛋白-1能与非受体型酪氨酸激酶Src家族中的野生型Src(c-Src)直接结合，而不能与突变型Src(v-Src)形成稳定的复合物,并发现小凹蛋白-1和c-Src共表达时可显著抑制c-Src活性；受体型酪氨酸激酶如EGF受体和PDGF受体,均集中于小凹,受刺激后可募集多种信号分子到小凹膜。

④胰岛素受体(Ins-R)： Ins-R也是一种受体型酪氨酸激酶, 小凹蛋白-1, 小凹蛋白-3能与位于小凹膜上的Ins-R直接作用。

⑤内皮型一氧化氮合酶(eNOS) ： eNOS是内皮细胞合成NO的关键酶，它的活性主要位于小凹膜上,其催化部位有与小凹蛋白脚手架区相连接的序列。在静息状态下,eNOS与小凹蛋白-1结合而活性受到抑制。在受到缓激肽等胞外信号刺激时,细胞内Ca²⁺浓度升高, CaM与eNOS结合,eNOS与小凹蛋白-1解离开,使eNOS被激活并移至胞浆内,促进NO合成。当细胞内钙浓度下降时,eNOS与CaM解离而与小凹蛋白-1结合,活性受到抑制。通过上述过程,动态调节eNOS活性。

综上所述, 许多信号转导途径的信号分子均集中在小凹，小凹是信号转导的枢纽。小凹蛋白对其中多种关键性信号分子的活性态起直接调控作用,特别是负性调控作用,从而参与细胞分化、增殖、衰老、炎症、肌病、肿瘤发生等多种病理生理过程。

4、小凹的分布与变动形成穴位的多样性

所谓经穴，就是分布在经络上的穴位，这一古典经穴，其物质形态就是血管腑腔壁平滑肌路径上的“信息站”。经络上还有一种功能不稳定的穴位，这种虽长在血管腑腔壁平滑肌细胞上，但构建穴位微观形态的小凹结构不稳，小凹聚集数量忽多忽少、导致细胞信号功能忽强忽弱，因而形成经络上随机性的阿是穴。

沈林霞等在论述胆固醇变量对小凹的结构和数量破坏时说：“Caveolin直接与细胞膜胆固醇相连促进Caveolae的形成。减少Caveolae胆固醇含量，可以破坏Caveolae结构，并减少Caveolae数量，从而干扰Caveolin的功能和定位^{［25，p866］}”。

雷雪用实验证明：人工可孵育和破坏小凹结构，并能显著上调或下调小凹蛋白。①用5 mmol/L甲基-β-环糊精（MβCD）能有效干扰体外培养血管平滑肌细胞（VSMCs ）膜上的小凹结构，可显著下调Cav-1蛋白表达。②用100ug/L 肿瘤坏死因子α（TNF-α）能显著上调体外培养VSMCs细胞膜上Cav-1蛋白表达。③Cav-1 蛋白表达上调后可明显增加内皮素（ET-1）诱导的VSMCs 胞内钙浓度升高程度，而MβCD 有效干扰破坏小凹 结构、导致Cav-1 蛋白表达下调后，可明显降低ET-1 诱导的VSMCs 胞内钙浓度升高程度^{［26，p45］}。

由此可推测阿是穴多数为经络上非穴（简称经非穴），因其细胞胆固醇含量时多时少造成小凹数量及小凹蛋白功能低而不稳。王苓苓^{［27，p50］}对经非穴研究时认为： “针刺经上非穴仍有较强的局部效应，在针后即刻可达到接近50％的升高，…但即刻效应比经穴要弱一些，针刺合谷的局部即刻效应达到60％。…循经效应总体上看，针刺经上非穴仍有一定的循经效应，但比合谷组要弱约一倍”。

传统经穴也不是一成不变的，这可从经穴电特性反应出来。 2009年德国的Kramer等^{［28，p686］}研究发现经穴的低电阻特性具有相对性： “631个测试点中有62．8％的穴位测量点与周围皮肤的电阻无差异，163个穴位测量点显示低于周围皮肤，71个穴位测量点显示高于周围皮肤，穴位的特异性表现不明显”。由此表明这里所测的经穴，其电阻有些还会等于或高于周围皮肤而失去低电阻特点，并不是所有经穴具有的低电阻值会时时保持不变，同时穴位也并不能完全囿于传统经穴研究范畴。

上面Kramer的测试结果也应证了本文前面对经穴的微观形态及四.㈡.2节“小凹增减因素”的表述，间接解答了“有些经穴会失去低电阻特点”的产生原因：有些组织细胞上的穴位微观形态和数量会经常发生变动，自然也会导致经穴电特性的变量，而不是一个固定值。也正因为穴位微观形态和数量的经常变动，所以经穴效应的稳定性、经穴的特异性也会发生变异，只能是相对的、而不是绝对的。

除了以血管腑腔壁平滑肌为物态的经络上由众多小凹融合成长管形、葡萄串式组成的经穴外，小凹还在非经络地带有较广泛的分布。比如Cav-1、Cav-2分布于上皮细胞、内皮细胞、成纤维细胞，Cav-3主要在心肌、骨骼肌等肌细胞分布，这些分布在非经络物质基础上聚集密度或大或小的小凹群，也具有可以显现的穴位微弱功能。这种略显微弱功能的穴位，可能在身体某一部位、某一运行时刻，聚集和显现出较强的局部穴位效应。黄永梅的炙疗经验就佐征了这一经络线外的穴位功能现象，她^{［29，p64/63］}说：“开始给人治病时,我用的都是灸传统穴位。后来发现了反应点可以治病,就很少灸传统穴位,而多采用反应点。特别是那些拖了很久的慢性病,用得更多些。从笔者治过的病例来看,这个方法应用范围很广。内科,妇科,儿科,五官科,伤科后遗症,只要有反应点的,都可以使用。若无反应点,人为寻找隐性反应点灸”。并特别提醒:“不论哪一种病的反应点,都不是恰好出现在某一经脉上,而是出现在某一经脉的循行区域。有时,反应点出现在两条或多条经脉之间,说不上它到底应当归属哪条经脉。”

这种反应点属于临时性穴位，应称为经络外穴或经外穴。经外穴没分布在经络上，即不长在血管腑腔壁平滑肌细胞上，缺少循经性。像脱离传统循经性穴位的腕踝针、浮针疗法等等，它们获效的物质基础可能就是经络外穴的微观形态、小凹微弱功能的随机汇集。所以不同于经穴效应的浮针疗法等：“不做捻转提插等手法,不要求得气，反而要求尽量避免患者有酸麻重胀等得气感”^{［30，p733］}。因为腕踝针、浮针疗法等针穴缺少循经性，所以无需要求得气。这可能提示反应点穴位的非特异性。

西方国家针灸也采取和流行刺激点或者扳机点（扳机点是指骨骼肌内压痛点）。他们采用经皮电刺激或者浅刺，主要治疗体表肌筋膜痛，在临床应用上淡化穴位，不言穴位和经络作用。有些中国学者对此担心：中国针灸学科将会沦落为“体表刺激疗法而失本来的合理内涵。按魏稼先生的话就是废(穴位)理论而存实践，只能使中医(针灸)本能结构受到破坏，从而把它推向覆灭的深渊”^［31］ 。

如果辩证的审视中医针灸学，否认经穴的循经效应将会对经络理论产生巨大的冲击，但如果正视临床实践中出现的针炙反应点、扳机点疗效并加以科学解释，则将打开针炙学新的视野。

问题的关键是：除了古典经络固定性的经穴外，还存在经络外域多种组织细胞分布的小凹微观形态随机增加或汇集的偶发性穴位，可称“泛穴”或“反应点”。因此，穴位似乎可以划分为经穴（腧穴）、经非穴（阿是穴）和经外穴（泛穴或反应点）。我们既要注重经穴的特异性，又要看到经外穴的非特异性，还要注意到前面王苓苓所说的“针刺经上非穴仍有一定的循经效应”，即经非穴（阿是穴）兼有特异性与非特异性两面。穴位概念要比经穴更宽泛，机体经穴不是“独生子”、身边还有其它众多穴位的“小兄弟”。不过相对古典经穴来讲新添了穴位的多样性概念，只要我们大脑增加了“穴位多样性”这一概念，我们就不会过于介意和强调 “保卫”经穴的特异性了。

面对穴位多样性、穴位微观形态小凹的易变性、以及钙离子浓度的瞬变性，如果要求中医针炙学实行循证医学则有很大的难度。假如针对古典稳定性的腧穴循证，通过应用现代科技理论努力探索倒可以达到。但对穴位微观形态易变、功能微弱的经非穴和经外穴，即阿是穴或反应点疗效要求“可重复”则难为之。西医把机体组织的结构及机能的固定性代替或掩盖中医穴位、钙离子的形态及功能的可能漂移性，不去辩证看待和分析问题，一概强调和苛求“循证”“还原”，因而陷入和固守机械还原论。