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2017-01-05 
OmicShare问答第四期 lncRNA测序数据挖掘 
OmicShare问答栏目由各位OmicShare网友在线交流课堂中，问交流嘉宾的问答整理。旨在解答众网友的疑问，普度众生。所以，你来问我呀。 OmicShare网址：www.omicshare.com 问1：super-enhancer会被转录为RNA吗？ 答：是的。 已经有相关报道表明，enhancer通过产生 enhancer RNA（来源增强子的lncRNA）来起到转录增强的调控作用。因此，Super enhancer 极有可能被转录为 lncRNA。 lncRNA的鉴定主要包括：1）同源比对；2）编码蛋白能力的预测。 前者，主要是是一些序列收录的数据库，例如 noncode 数据库。如果能在这些数据库中找到同源序列，就可以对lncRNA 进行初步的判定； 如果是后者，还是需要自己使用一些软件，例如 CPC ，进行分析。暂时还没有听说，哪些数据库提供蛋白编码能力预测的分析。 问3：怎么做lncRNA的功能？有些什么机制？好像筛出来lncRNA但机制并不好做。 答：包括：敲除，过表达、pulldown 等。只要在 CNS 级别的期刊，一般在找到候选lncRNA后，会有详细的功能验证试验。机制验证的试验当然不好做，要找到正确的候选lncRNA，且试验比较耗费时间。难度越大，文章回报也越高。 问4：对于lncRNA，预测的RPKM值低于多少认为其没有表达? 答： 这个要看需要，一般情况0.01以下就可以认为不表达。 问5：测序出来的结果包括lncRNA和mRNA，那是不是测序的数据量要比普通的mRNA测序要大？ 答：是的。目前大部分测序公司推荐的lncRNA测序量是10g。推荐测10g有2个原因吧。第一个原因，因为毕竟同时测lncRNA与mRNA本身信息比较大，自然需要更大的数据量；另外lncRNA表达量相对低一点，所以需要测到lncRNA的话，理论上就需要更深的数据量。但同时有个问题，因为测lncRNA是采用去核糖体RNA的方法，去核糖体RNA的方法无法保证能够把核糖体去得干干净净的，所以最后的测序数据里面都会多多少少比较多的核糖体的残留，那意味着我们有效的数据就偏少，所以需要比较大的数据来保证有效数据。就是说测得多才能保证剩下的数据是足够的。 问6：对于那些lncRNA表达量大，而它的靶标表达量小，这种也算共表达吧？ 答：共表达并不是指的表达量，而是表达趋势，当然量太小也没有意义。 答：纯分析的角度是可以的。但是目前我们接触到的文献关于原核生物lncRNA的报道还比较少，所以说在原核生物上做lncRNA还是有风险的。并不是说不能做，而是说担心没有或很少。另外，我们都知道用原核生物来做转录组的话本身就是去核糖体的策略，因为原核生物编码基因也没有poly-A尾结构，所以如果你做原核转录组测序的话，也是可以顺便分析一下lncRNA，这个是没有问题的。 问8：请问，针对含有病菌的叶片组织，能否有效去除或者区分病菌的lncRNA？能否一个同时针对病菌和植株进行lncRNA分析？ 答：嗯，这个问题问得挺好的。因为这个也是病原宿主互作经常遇到的问题。理论上来说，你的叶片是有病菌感染的，做了测序之后是可以将病原与宿主的基因测出来的。不过最大的问题是，微生物的基因丰度会非常低。这里分析的话有2个难点，一个是必须保证微生物的丰度基因足够多，那意味着你取样要很准，如果取样不准的话，你取样组织里面大量是健康的植物细胞，只有一部分是有微生物感染的，那么在你最后提的RNA里面，微生物的基因丰度极低，极低的话意味着你通过测序的话，病菌的RNA将检测不到或检测太低，那么表达量的信息就不准，所以第一个就是这个微生物问题。 然后第二个问题是，能够有效区分、去除病菌的lncRNA，去除病菌的lncRNA的话意味着病菌要有参考基因组，如果没有参考基因组，也就没有办法对病菌lncRNA进行分析的。 问9：许多lncRNA与mRNA是有重叠的，因此在设计引物做RT的时候，是不是要避开这部分重叠的部分？ 答：这个问题也问得非常好，我们认为由2种情况，第一种lncRNA与mRNA如果在反义链上还好，比如一个在正链上，一个在反链上，因为有5‘ 3’，所以这个设计引物是没有问题的。如果是第二种情况，应该找两种序列特异的部分设计引物。 问10：如果从单核糖体和多核糖体上分离RNA来做测序，只发现一个lncRNA，这种数据准吗？ 答：这个问题很难回答。因为现在核糖体相关的RNA测序也是目前比较火的一个技术。目前这个技术更多的是研究与核糖体结合的mRNA。目前做过转录组和蛋白组关联分析的老师应该清楚，他们之间的转录组与蛋白的关联是非常差的，因为目前蛋白质谱的技术不怎么稳定，所以定量不是很准；另外从mRNA到蛋白中间经历了很多转录或修饰等等变化，所以蛋白的表达量与mRNA的表达量相关性很差，所以目前采取核糖体mRNA来测序的技术。据文献报道这种测序技术，结果是与蛋白相关性很强的，因为，既然是mRNA结合在核糖体上，那么基本上认为是可以翻译的。但是如果说找到一条lncRNA，这个到底准不准不好说，也有可能吧。因为lncRNA功能很多，在某些情况下是可以翻译一些小肽的，所以我认为说分离出lncRNA是正常的。 问11：lncRNA和miRNA共表达分析，据说不靠谱，不太可信，是不是这样？ 答：我的观点是，所有的生物信息分析都是预测。这个不靠谱取决于样本量，样本量越少假阳性越多，样本量越多假阳性越少。然后是后续的数据解读吧。 问12：那如果一个物种即做了转录组，又做了蛋白组，怎么解释和取舍？ 答：不同的分析使用不同的算法，取舍不一样。我的建议是，整体还OK的话，就写一篇文章吧，但如果一致性真的很差的话，那么你就写2篇文章。 问13：在转录组数据中，通过后续分析发现unigene里面有内含子，并且有些unigene很长，有超过10000bp，怎么会这样呢？ 答：如果unigene超过10k，这个很有可能不是RNA，很有可能是DNA残留，是一条DNA序列，也有一定可能是mRNA前体，但很大可能是一段DNA序列。 问14：如果找到一个lncRNA，如何找到下游靶点来做呢？ 答：建议找到lncRNA的话，建议优先从顺式作用考虑，看看周边有没有有意思的mRNA，不过总体来说从lncRNA来找mRNA会比较困难。可能需要双方面来找，建议先别确定某个lncRNA，可以挑几个表达量比较高的lncRNA，再看看周边有没有有意思的mRNA，然后再确定lncRNA来找下游靶点。 |
