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近年来，为了提高对肿瘤的早期检测、鉴别诊断、疗效观察以及预后判断，人们从肿瘤细胞的化学特性、细胞病理、免疫反应和基因表达产物等诸多方面寻找各种特异性强、灵敏度高的肿瘤标志物。 一、染色体核型介析 染色体核型分析是以体细胞分裂中期染色体为研究对象，分析生物体细胞内染色体的长度、着丝点位置、臂比、随体大小等特征。正常人的体细胞染色体数目为46条，并有一定的形态和结构。染色体在形态结构或数量上的异常被称为染色体异常，由染色体异常引起的疾病为染色体病。经核型分析后。可以根据染色体结构和数目的变异来判断生物的病因。现已发现的染色体病有100余种，染色体病在临床上常可造成流产、先天愚型、先天性多发性畸形，以及癌肿等。临床上染色体检查的目的就是为了发现染色体异常和诊断由染色体异常引起的疾病。在常用染色体显带技术和分子遗传学技术的运用下，可以清晰地观察到与肿瘤有关的染色体畸变，如染色体数目异常，染色体易位、缺失，染色体上肿瘤相关断裂点、脆性位点、癌基因位点。在肿瘤的诊断上，染色体核型分析是一个必不可少而有益的诊断依据，可以发现那些由于染色体畸变而引起的肿瘤。 肿瘤相关断裂点、脆性位点和癌基因位点或一致，或重叠，或相邻，其中癌基因位点c-myc、c-mos、Ha-ras-1、c-ets、bel-1、akt-1、bcl-2、yes-1及L-myc与相应的肿瘤相关断裂点和脆性位点共处同一染色体部位，具有位点的一致性。三类染色体位点一致可能构成一个潜在的肿瘤启动部位，因为在某些人类恶性肿瘤中三类染色体位点的一致性是常见的特征。例如，肿瘤相关断裂点8q24染色体区是构成恶性淋巴瘤、Burkitt淋巴瘤、急性淋巴细胞白血病L3、急性非淋巴细胞白血病M2等恶性肿瘤多种染色体重排的一个重要的断裂点，它不仅是脆性位点Fra8c的所在部位，也是癌基因c-myc的位点。肿瘤细胞染色体除了以上肿瘤相关断裂点、脆性位点、癌基因位点外，还表现为染色体数目和结构的异常，在95%以上的不同类型肿瘤细胞的中期染色体存在数目异常和结构异常。三类位点的存在是染色体结构异常的因素，而染色体数目的异常是由于染色体的分离失调导致的三倍体性或多倍体性，复制特殊染色体的区域节段也可引起基因产物的不平衡。 染色体数目、结构异常的观察除了传统的染色体显带技术外，还可采用分子遗传学技术。荧光原位杂交（FISH）是目前广泛应用的一种非放射性核素原位杂交技术，在基因定位、标记染色体和识别染色休结构和数目异常的分析研究中具有重要意义。以DNA特异探针与染色体杂交的方法称为染色体描绘技术。由于其具有灵敏、快速、准确、同时显示多种颜色及易于观察等特点，在染色体分析研究中具有重要的应用价值，特别是在染色体分散程度较差或异常标记染色体来源，普通显带无法辨别的情况下进行核型分析，染色体描绘技术有它独特的优越性 二、癌基因检测 目前对癌基因的分子诊断方法很多，以经典的癌基因--ras基因为例，可以利用PCR-SSCP、DGGE、PCR-ASO和测序技术、Southern印迹法、Northern印迹法及Western印迹等方法进行检测。迄今为止，虽然已发现了近100种癌基因和肿瘤发生、发展有关，但仅有少数几种癌基因及其编码的癌蛋自可在血清中检出。 （一）ras基因 ras族基因编码酪氨酸激酶，位于人类1号染色体短臂，它的表达产物为p21蛋白，由K-ras、H-ras和N-ras组成，在DNA水平上三者高度同源，均有4个外显子，相互间同源性达85%。当ras基因的第12位、第13位、第61位碱基发生点突变，编码产物发生变化，这是癌症形成的关键一步，又称启动基因。临床上，ras基因突变多见于神经母细胞瘤、膀胱癌、急性白血病、消化道肿瘤、乳腺癌，在上述疾病时ras基因突变后的表达产物p21蛋白增加，并且和肿瘤的浸润度、转移相关，在肿瘤患者ras基因的突变率约在15%~20%。也有研究指出p21在良恶性之间无鉴别价值。如胃良性病变-肠化和异型增生上皮中ras的阳性率与胃癌组织阳性率无显著差异。 （二）myc基因 myc基因是从白血病病毒中发现的，它和转录调节有关，其表达蛋白是的磷酸蛋白p42，myc基因和DNA合成、细胞信号转录、细胞分化相关，尤其在G1期和S期myc表达最强。最早人们在B、T淋巴细胞瘤、肉瘤、内皮瘤病发现。myc基因的激活，以后又发现小细胞肺癌、幼儿神经母细胞瘤的临床进展和myc基因表达扩增有关，而且多见于转移的肿瘤组织，目前myc基因蛋白标志物主要用于判断肿瘤的复发和转移。 （三）erbB2基因 erbB3-2基因又称HER-2/neu基因，属于src癌基因家族，和表皮生长因子受体（EGFR）同源，在结构和功能上都和EGFR相似，能激活酪氨酸激酶。表达蛋白为p185。erbB-2基因通过基因扩增而激活，它多见于乳腺癌（Paget病）、卵巢癌和胃肠道肿瘤。虽然erbB-2基因蛋白在诊断乳腺癌中阳性率不高，仅25%~30%，但它在乳腺癌诊断中特别有价值，它和肿瘤的大小、雌激素受休、孕酮受体一样可判断患者的预后，其准确性只比转移导致的淋巴结数目略差，在乳腺癌诊断中被看做一个独立的指标。erbB-2基因蛋白增加患者预后较差，极易复发，存活期短。 （四）bcl基因蛋白 bcl基因是在造血系统肿瘤中首先发现的一个癌基因，位于18号染色体长臂，通过抑制细胞死亡而参与肿瘤的发生。除正常造血组织外，bcl基因主要分布在腺上皮、外分泌腺体的导管细胞和增殖细胞上。bcl基因在各类淋巴瘤、肾脏肿瘤、急慢性白血病、霍奇金淋巴瘤、乳腺癌和甲状腺髓样癌等病中均可呈阳性。 三、抑癌基因检测 抑癌基因的缺失或者点突变也见于大多数人类肿瘤，如肺癌、胃癌、乳腺癌、结肠癌、肝癌等。抑癌基因的检测方法与癌基因分子诊断方法类似。 p53基因是一种抑癌基因，通过控制细胞进入S期，控制细胞分化，监视细胞基因组的完整性，阻止具有癌变倾向的基因突变的发生。野生型的p53基因突变使这一控制作用消失，诱发肿瘤。许多肿瘤与p53抑癌基因异常有关，p53基因的点突变常见第175、248、273位的碱基对变异，而在肝癌细胞中p53基因第249位的碱基对由鸟嘌呤变成胸腺嘧啶。突变的p53蛋白半寿期较长，因而在大部分肿瘤患者中都可测到突变的p53蛋白，尤其是乳腺癌、胃肠道肿瘤、肝细胞癌及呼吸道肿瘤，阳性率为15%~50%。 除了癌基因和抑癌基因，肿瘤相关基因中还有两类关系密切的基因，即肿瘤转移基因和肿瘤转移抑制基囚，它们也可以用于肿瘤的分子诊断，尤其是判断肿瘤有无转移，对临床治疗很有帮助。目前研究较多的一种肿瘤转移抑制基因是nm23，到目前为止，nm23已经在胃癌、骨肉瘤、膀胱癌、乳腺癌、肠癌等具有转移潜能的肿瘤中呈现低表达，在大肠癌中nm23低表达与肿瘤状态和远距转移密切相关，因此，可以依据nm23的表达程度判断肿瘤有无转移，1991年国外已经将其列为肿瘤分子诊断的常规检测项目。 四、癌病毒基因检测 流行病学调查和分子生物学研究表明，病毒与人类肿瘤之间确实存在着密切的关系，如肝炎病毒（HBV、HCV）与肝细胞癌，EB病毒与鼻咽癌。人乳头瘤病毒与子宫颈癌，人类T细胞白血病/淋巴瘤病毒Ⅰ型（ HTLV-Ⅰ）与成人T细胞白血病/淋巴瘤有直接关联。因此，如果利用分子诊断的方法，如杂交、PCR等方法检测这些肿瘤相关病毒的基因，就可以为某些肿瘤的诊断提供参考依据。如用PCR方法扩增HPV病毒基因E6和E7开放读框上特异的230~270bp基因片段，可早期诊断HPV-16、HPV-18的感染，对早期预防和诊断子宫颈癌有重大意义。 五、化学致癌相关指标 鉴于化学致癌物存在的广泛性以及预防肿瘤发生的可能性，各国采取一定的法规来控制化学致癌物散播，因而产生了化学致癌物的体外检测。早年，为了证实某一物质的致癌性，常需要进行“三致”试验，即致突变、致畸变、致癌试验。致突变试验花费少、需时短；而慢性动物致畸变试验、致癌试验结果可靠，但费时、费力、费钱，不宜用于初筛。后来发现，致癌物大多是致突变物，故对化学致癌物的体外检测先做致突变试验用于初筛，亦可用一组试验相互引证。初筛试验阴性者可以不必进行致畸变、致癌试验；阳性者再进行致畸变、致癌试验。国家规定对新药、食品添加剂、化妆品、饮料等需要进行“三致”试验，以确保使用的安全性。常用的致突变试验有3种： （一）艾姆斯试验 艾姆斯试验（Ames test）。又称鼠伤寒沙门菌回复突变试验。常用几个组氨酸缺陷型突变鼠伤寒沙门菌株，在检测系统中还包括大鼠的肝脏微粒体活化系统，其中的微粒体酶S9能使一些前诱变剂转变为诱变剂。虽然在这里测试对象是细菌而不是哺乳动物，但是由于这一检测系统简便易行、灵敏度较高，所以常用来作为诱变物质检测初步筛选的短期测试系统，用这种方法已经对几百种物质进行了测试，发现大约90%的致癌物质具有诱变作用。Ames试验的特点为：①均有组氨酸基因缺陷，不能产生组氨酸为其本身的营养，因而在培养基中需加入组氨酸，该菌才能生长，这是该细菌突变的结果；②亦有切除修复基因的缺失菌，因而突变后不易修复；③有碱基置换型突变株（TA97，TA100）与移码型突变株（TA98，TA102），可观察突变的类型；④若在试验中这些突变株在无组氨酸的培养基中培养时有大量菌落生成，说明致突变物使细菌发生了回复突变，亦即表明待测物为致突变物。 Ames试验的检测方法：将待测物，经或不经肝微粒体酶S9处理，加在缺组氨酸的培养基上，观察组氨酸缺陷型突变鼠伤寒沙门菌菌落生长的结果，可以测出：①被测物有无致突作用；②若有，是直接致突变物，还是间接致突变物；③观察致突变作用的强弱。 （二）哺乳动物培养细胞染色体畸变试验 染色体畸变试验是取哺乳动物原代细胞（人血淋巴细胞）或传代细胞（中国仓鼠细胞，CHO），培养中加入已经或未经S9处理的被检物，两者共孵育24小时，加秋水仙碱进行染色体分析。观察染色体数目（非整倍体、多倍体、内复制）与结构的变化（各种染色体畸变）。若出现染色体畸变，说明该物具有致突变性。 （三）微核试验 微核试验是哺乳动物骨髓嗜多染红细胞微核试验的简称，它是一种体内试验。将被检物以一定浓度注入小鼠，在1天、2天、3天后杀死小鼠，取其股骨骨髓进行涂片，吉姆萨染色，观察并计数1000个嗜多染红细胞内微核的百分数。微核的出现或增多常意味着染色体的损伤，说明有致突性。 应该指出，致突变试验仅是一种初步探查，虽然约有84%的致癌物为致突变物，有一定的指导意义，但亦不可忘记有相当部分非致癌物有致突变作用，所以若致突变试验阳性，应采用多种方法反复验证，或进行致畸变、致癌试验。在确定了某一化学物质的致突性，甚至动物实验证实其致癌性以后，要确切了解其对人体的致癌性及其机制，目前常用分子流行病学的方法检测人体内致癌物的衍生物。肝癌是世界上最常见的恶性肿瘤之一，其主要病因与当地HBV感染、食用被黄曲霉毒素污染的玉米有关。例如在中国江苏启东，检测当地黄曲霉毒素B1（AFB1），确认它是Ames试验阳性，能使培养细胞发生染色体畸变、微核试验亦为阳性、在多种实验动物中能诱发肝癌，但为了确定其对人体肝癌的引瘤作用及其与暴露剂量的关系，研究了该地区人群尿中AFB1-鸟嘌呤加合物的浓度，发现尿中AFB1-鸟嘌呤加合物的水平随地区不同而不同。与当地饮食中对AFB1的暴露量相一致，且与肝癌的发现率密切相关。这些研究对化学致癌的机制具有重要的意义。在体外试验、动物实验和人体研究中，AFB1引起的突变谱亦是一致的。AFB1诱发的特异性碱基改变使这种转换可在暴露于AFB1的人肝细胞培养的p53中检测到，常见的是第249位密码子的突变。在同一地区人类肝癌中一突变多见p53的第249位密码子的G∶C→T∶A转换。居住在该AFB1污染区的人群非癌患者正常肝脏的这一突变数亦增加。 六、肿瘤的分子检查 1.循环肿瘤细胞 肿瘤的分子诊断包括肿瘤标志物基因的检测，mRNA、miRNA的检测和蛋白质的检测。对于肿瘤标志物基因，可以针对其保守序列，利用核酸探针杂交、PCR-SSCP、DGGE、PCR-ASO、DNA序列测定和基因芯片技术进行检测；对于mRNA和miRNA的检测可以利RT-PCR、荧光定量PCR、斑点杂交等方法进行检测；对于蛋白质的检测，可以利用Western印迹、流式细胞术、免疫组织化学和蛋白质芯片技术进行检测。肿瘤的分子诊断标本包括体液和肿瘤组织等，其中血液中的循环肿瘤细胞（CTC）检测可用于肿瘤的体外早期诊断、化疗药物的快速评估，个体化治疗的临床筛药、耐药性检测，肿瘤复发的监测以及肿瘤新药的开发等，另外通过检测循环肿瘤细胞的数量，可以诊断肿瘤，评估疾病的进程、转移复发、治疗效果。 通常把进入人体外周血的肿瘤细胞称为CTC。由于CTC同其他血细胞相比并没有显著的特异性，而且不同组织学类型和分子表型的肿瘤分别表达不同的标志物，再者CTC在外周血中数量稀少，一般在106~107个白细胞中仅含有1个CTC；因此对于CTC的检测和分析通常都包括富集和检测两个步骤。富集的方法之一是根据形态学标准，如细胞的大小、密度等不同将其分离，如采用密度梯度离心法；而另一种方法则是根据目的细胞上带有可用于免疫学分离的特异性标志物将其分离，常用的是免疫磁珠法。细胞富集结束后。基于细胞计数的方法或基于核酸的技术通过公认的肿瘤特异性标志物对CTC进行检测和分析。基于细胞计数检测CTC的方法是根据细胞的抗原表达分离和计数CTC，使用诸如抗上皮特异性抗原的抗体；它相对于核酸分析的方法，优势在于目的细胞未被破坏，能进一步分析其细胞形态学和分子学特性；不足之处是缺乏肿瘤特异性抗体。目前比较常用的细胞角蛋白（CK）抗体能与巨噬细胞、浆细胞以及有核造血细胞前体特异或非特异结合。多种标志物联合使用能有效提高检测的敏感性和特异性。在对结直肠癌的研究中，采用流式细胞术（FCM）可从每7.5ml外周血中检出2个CTC，并发现CTC的数量与肿瘤分期相关。光导纤维阵列扫描技术（FAST）能从大量免疫荧光染色的单核细胞中找出CTC，与常规显微镜相比，避免了纯化和富集步骤造成的CTC丢失。这一技术在结直肠癌以及乳腺癌的细胞系掺加试验中平均的敏感性达到了98%。雷射扫描细胞计数器（LSC）提高了扫描荧光染色细胞的有效率。自动细胞显像系统（ACIS）是一种能更快检测载玻片的自动扫描显微镜，多种其他的自动扫描系统在这一免疫细胞化学的检测中被联合应用并被证实具有非常好的协同性。基于核酸检测CTC的方法是通过检测肿瘤细胞特异的遗传学改变来加以确认。DNA的改变，如原癌基因、肿瘤抑制基因的突变，微卫星不稳定性以及致瘤病毒序列均可被用于检测。CTC与肿瘤转移关系密切，随着肿瘤特异性标志物的发现以及检测手段敏感性与特异性的提高，CTC的检测将具有巨大的潜在临床应用价值。 应用流式细胞仪检测。 2.血浆肿瘤游离DNA 健康人外周血游离DNA大多来源于血细胞，而肿瘤患者外周血游离DNA主要来源于肿瘤细胞。许多研究人员也证实了在肿瘤患者血浆中游离DNA含量较正常人群增高的现象。尽管关于肿瘤患者外周血游离DNA的来源还未完全了解，但其增加可能与肿瘤细胞坏死或凋亡、循环肿瘤细胞及微转移灶有关。 肿瘤患者血浆中游离DNA的改变包括了DNA含量改变、基因突变、表观遗传学改变、杂合性缺失、DNA完整性改变及病毒DNA出现等。目前主要采用的检测方法有荧光定量PCR、酶联免疫吸附试验、DNA测序技术等。但由于检测方法的原理及敏感性不同，各报道结果差异较大。寻找特异性、敏感性更高的检测方法对肿瘤循环游离DNA的研究有重要的意义。 3.微RNA 微RNA （miRNA）是一类普遍存在于细胞中的长度为18~25nt核苷酸的非编码单链小分子RNA。miRNA在基因转录后水平上通过与靶mRNA互补结合，抑制mRNA的翻译或降解mRNA，发挥对约30%人类蛋白的表达调节作用。在肿瘤发生和发展中，miRNA表达蛋白质谱发生改变，抑制肿瘤的miRNA （TSmiRs）表达减少，而促进肿瘤的miRNA（oncomiRs）表达增加。miRNA既可能发挥致癌基因的作用，也可能发挥抑癌基因的作用，miRNA的变化是肿瘤发生的早期事件，为此认为，miRNA在多种疾病，特别是肿瘤疾病的诊断中可作为一类生物标志物。目前研究报道，促进肿瘤的miRNA，即发挥癌基因作用的miRNA，如结直肠癌中miR-17-92家族成员.具有促进细胞增殖、抑制凋亡、导致肿瘤发生并恶化的作用；肝癌组织中miR-21、miR-18、miR-9等呈现高表达；发挥抑癌基因作用的miRNA，如结直肠癌中miR-143、miR-145，呈低表达；肝癌组织中抑制肿瘤的miRNA有miR-16、miR-122、miR-195等，分析和检测这些miRNA表达谱的差异，对肿瘤的分子诊断、分期、转移复发和预测具有重要临床意义。 miRNA的检测多采用miRNA芯片和荧光定量PCR法。标本可用新鲜组织、石蜡包埋组织或于血清或血浆标本中提取。 作者：黄山 |
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