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细胞复苏、传代及冻存实验步骤: 一 复苏 传代 （ 1） 准备 无菌超净台，酒精灯，75%酒精喷壶，CO2培养箱，37℃水浴锅，离心机；培养瓶，含10%胎牛血清的完全培养基和基础培养基以及PBS磷酸缓冲液（提前放置超净台使平衡到室温），无菌工作服（白大褂），口罩，手套，记号笔 （2） 步骤 1穿好无菌工作服，带上口罩和手套，快速从液氮里取出冻存管，快速放进37℃水浴锅缓慢摇晃使细胞解冻，注意冻存管的封口膜不要破裂，防止污染。 2 解冻后用纸擦干冻存管表面的水滴，酒精喷壶喷洒适量75%酒精消毒冻存管封口处。 3 开超净台，点燃酒精灯燃烧片刻后（可提前准备），冻存管放超净台，换新手套，小心打开冻存管，避免污染，无菌吸管将1ml细胞全部吸出至5ml无菌EP管，补加9ml基础培养基稀释，1000rpm，离心5min使细胞沉淀，弃上清。 4 加入新鲜配制的含10%血清的培养基4ml，轻轻混匀，用吸管将细胞移至25T培养瓶。 5平躺放置培养瓶，8字形混匀后，置于37℃，5%CO2培养箱培养。 6培养24小时后，显微镜观察细胞（贴壁细胞）贴壁后，小心更换培养基，继续培养，根据不同细胞的生长状态进行传代培养，培养瓶上标记：操作者，时间，细胞类型。 7有的实验员的培养基会加入抗生素防止细胞污染，但是这对于掌握细胞培养是非常不利的，不加抗生素培养细胞更能提醒实验者无菌操作的意识。一旦细胞出现污染，易于发现，一旦发现污染的细胞应立刻煮沸丢弃，以免污染同实验室其他细胞。 8细胞长满90%-100%即可传代，小心打开培养瓶，瓶口过酒精灯消毒，弃培养基。 9加入1mlPBS，润洗细胞，重复3次，弃PBS。 10加入4ml完全培养基，用无菌吸管小心吹打贴壁细胞或者用胰蛋白酶消化细胞使细胞脱落。 11转移1/2脱落的细胞至新的培养瓶，各瓶补加完全培养基至4ml。 12小心封口，平躺放置培养瓶，8字形混匀后，置于37℃，5%CO2培养箱培养。 13待长满后，按同样的方法传代培养。 二 冻存 当不需要使用细胞或者细胞量足够时，可以将细胞冻存起来，供以后实验用 （1） 准备 细胞冻存液（20%血清、10%DMSO、70%基础培养液），梯度降温盒 （2） 步骤 1选取活力好，密度约70%细胞用于冻存，此时细胞处于对数生长期，最适合用于冻存。 2 细胞吹打或者胰酶消化后，转移至无菌EP管，1000rpm里面5min。 3弃上清，加入新鲜配制的细胞冻存液，25T细胞可以加入2ml细胞冻存液，分装2个冻存管，细胞最佳密度为5*106-1*107个每ml。 4做好标记，放入梯度降温盒（提前平衡至室温）。 5将梯度降温盒放入-80℃冰箱过夜，第二天取出冻存管，快速放入液氮保存。 遵循“快速复苏，缓慢冻存”的原则。 |
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