Western Blot 原理、protocol

一、组织、细胞总蛋白抽提：参考相关裂解液；

二、蛋白浓度测定：BCA法，这个结果要参考说明书！

   准备：BCA试剂，BSA，PBS/生理盐水，96孔板，100ul、20ul、10ul移液*及*头，1.5ml及4ml EP管，冰河

1、配制BSA蛋白标准：配0.5mg/ml BSA，将25mg/ml的母液用RIPA 稀释成0.5mg/ml（RIPA可以换成PBS，下面的也是）；

2、将BCA试剂A与B按50:1（2450 A+49ul B）充分混匀，配置成适量BCA工作液(4℃)；

3、稀释BSA蛋白标准品和待测蛋白样品：用PBS稀释至20ul，再向每孔加入200ul BCA（ 在20-1000μg/ml浓度范 围内有较好的线性关系）

注：按RIPA-BSA-样本-BCA的顺序加入，操作要迅速！

4、锡纸遮盖，37℃恒温箱（或酶标仪）放置30min；

5、置于酶标仪上测定A562（或A570），用excel建立标准曲线然后计算出蛋白浓度；

注意：数据分析可以在Excel里做也可以在GraphPad Prism软件里做，R平方值越接近1数据越好

三、Western blot步骤：

（一）、玻板的清洗：

自来水→75%酒精擦拭→ddH2O→竖放晾干/吹干（做胶的一面朝内）【勿用手指触摸玻板内侧面】装板：

低的一面向内，确认玻板底部平齐，插入斜楔板压实卡紧，加ddH2O不漏，滤纸吸干水；

（二）、配胶（1.0mm）：      分离胶                                                           5% 浓缩胶， 3 ml/块胶

                               

注意：

①、用*吸取胶，沿玻璃板一侧注入，先快后慢，*头不要打到底以防产生气泡，胶面升到绿色板上缘，用75%酒精封闭液面；

②、室温放置约30min使胶充分凝固，待水和胶面之间有肉眼可见的折线，小心倒掉上层水，并用滤纸小心吸干水，勿碰触到胶面；

③、TEMED作用为促凝胶，如其他试剂放置时间较长或气温较低不易凝胶时，可适量多加1~2倍 TEMED，或者多加点AP，胶就会很快凝固的；

④、颠倒混匀后灌胶（约2ml），插入梳子，室温放置约30 min后，将玻板取出装入电泳装置，竖直向上将梳子拔出，放入电泳槽润湿板子，再拿出将玻璃板卡准；

补充下浓缩胶的作用：

链接：http://www.360doc.com/content/12/0319/10/2867540_195568487.shtml

（三）、点样及电泳：

1、用10 ul *吸取电泳液，倾斜45°反复吹打上样孔，去掉胶的残渣；

2、按顺序加样本，侧边孔加5ul marker，多余孔加入2ul loading buffer，迅速上样避免弥散；上样的量可以根据所测蛋白浓度来调整，有的建议20-40ug，有的50-100ug，其实个人觉得40-80ug比较适合的，主要看你样品浓度吧！

3、恒压80V 约20min；待样品进入二胶的分界线时（时间也不一定20min，跑到交界处就可以改变电压），120V 约90min（设I=200，T=2:00）(100mA的条件也跑过-六一产的）；

4、溴酚蓝跑至玻板底部，且Marker条带分的足够开时，停止电泳；

（四）、转膜：

准备（提前30min）：1×转膜液、培养皿、甲醇、PVDF膜、剪刀镊子、尺子、切胶板、托盘、转膜夹、冰袋及冰。

1、戴干净PE手套剪取PVDF膜（剪角做好记号以区分蛋白面），放入甲醇中浸泡约5min，用ddH2O平衡，再放入转膜液中15min；

2、轻轻撬开玻璃板，按Marker指示切下目的蛋白所在区域的凝胶，浸入转膜液中；

3、“三明治”：白板（+）→黑网→滤纸→PVDF膜→胶→滤纸→黑板（-）（记住蛋白带负电-向正极移动就行！）；

4、将夹子放入转膜槽中，冰浴恒流180mA 70min（其实200mA，90min比较好的）；

（五）、封闭：

提前配制封闭液（一直用的4% TBST配制的脱脂奶粉），将膜放入孵育盒中，于脱色摇床上60 rpm室温摇2h；

（六）、一抗孵育:

1、弃去封闭液，TBST洗1次×5min；

2、加入用TBST或5%BSA稀释的一抗（2%的TBST配制的脱脂奶粉，注意温度！特别是夏天，奶粉容易坏！），脱色摇床60 rpm 4℃ 过夜（或2-3h）；

3、回收一抗，TBST洗膜3次×10min，摇床80~100rpm；

(七）、二抗孵育：

加入用封闭液稀释的二抗，室温孵育60min；

TBST 洗5次×5min或3次×10min；

注意：洗膜时间可以稍微长一点，一抗和二抗的比例需要参考说明书，保存和回收条件也是，一抗是什么动物来源的，二抗就是抗一抗动物的抗体，比如说，一抗是来源于Rabbit，二抗就是Anti-Rabbit

（八）、ECL显色：

准备：显影液、玻璃片、保鲜、镊子、EP管、*及*头、滤纸。

在暗室中将ECL试剂以1：1混合（约100ul），用滤纸将PDVF膜稍干燥后置于玻板上，滴加适量显影液在蛋白面上， 显影；

选【印迹】-【Chemi】进行成像，actin设置10-30s、10张，目的蛋白设置20s-100s，20张，可延长至500-1000s；【其他】-【protein mark】进行marker成像；

注意：曝光的时间与蛋白大小有关系，一般小蛋白曝光时间短些，做多了就能找到合适曝光条件！

结果:

Marker                               目的蛋白