3D细胞打印仿生肾小管

肾脏是高度血管化的组织，可以滤过分子、调节体液及血压平衡，是保持机体内环境稳态的重要器官。随着组织工程肾脏研究的发展，仿生肾小球及肾小管可很好地在体外模拟肾功能，有效促进肾毒性检测、药物筛选及相关疾病模型的研究。此外，仿生肾脏也可缓解长久以来所面临的肾源短缺问题。因此，构建仿生肾脏具有较高基础研究及临床应用价值。肾脏的结构形式及细胞组成复杂，以往单细胞2D培养无法精准模拟肾组织多样化特征，随着3D打印技术的推广，加载细胞的3D生物打印方式可很好地复制体内组织器官结构和功能。近期，来自韩国浦项科技大学Dong-Woo Cho教授及天主教大学的Yong Kyun Kim教授团队以脱细胞肾组织基质（KdECM）混合海藻酸作为生物墨水，加载肾近端小管上皮细胞（RPTECs）及人源脐静脉内皮细胞（HUVECs），通过3D单轴细胞打印系统，构建血管化的单层及多层中空管型结构，以模拟肾组织（Fig. 1A-D）。

首先，研究者检测发现培养于KdECM中的RPTECs高表达GGT、AQP1、OCT2、ECDH以及 KSP-钙黏蛋白等特异性蛋白（Fig. 1E），而肾损伤相关蛋白KIM-1表达较低（Fig. 1F）。此外KdECM也可抑制纤维化蛋白（如αSMA、VIM及fibronectin）的表达。这表明KdECM可有效保证肾细胞功能并起到抗纤维化作用。

Fig. 1 Schematic of research and functional validation of KdECM bioink.

海藻酸混合钙离子易发生交联，可用于多种组织结构构建。本研究中，作者将KdECM混合海藻酸后加入钙离子通过热交联方式促进凝胶（Fig. 2A）。混合水凝胶的剪切变薄特性可反应其粘弹性，进而保证装载的细胞较高生物活性。研究中发现随着水凝胶剪切率的增加，其粘弹性逐渐降低（Fig. 2B）。此外，混合水凝胶的储能模量高于海藻酸及KdECM（Fig. 2C）。这表明装载细胞的混合水凝胶通过3D打印后的仿生肾小管组织可保持一定的结构完整性及力学特性。此外，RPTECs及HUVECs在混合水凝胶中的活性高于医用胶原，但低于KdECM，这是由于混合水凝胶中的海藻酸成分会降低材料整体生物相容性（Fig. 2D-F）。

 Fig. 2 Development of functional hybrid bioink.

接下来，研究者以装载有RPTECs的混合水凝胶打印出仿生肾小管的管型结构（Fig. 3A）。通过活死染色发现培养14天后，细胞显著增殖（Fig. 3B）。免疫荧光标记RPTEC特异性蛋白AQP1及OCT2提示各细胞间通过紧密连接形成成熟的管型结构（Fig. 3C, D）。此外管型培养的RPTECs中特异性蛋白表达高于其他培养条件，这表明管型结构更利于肾近端小管仿生构建（Fig. 3E）。

依据上述相同步骤，研究者以HUVECs装载的混合水凝胶打印出血管结构（Fig. 3F）。通过活死染色发现培养14天后，HUVECs也显著增殖（Fig. 3G）。并且培养14天后，HUVECs中高表达CD31，提示仿生组织血管化（Fig. 3H）。同时HUVECs也显著表达VE-钙黏蛋白，表明细胞间可形成紧密连接（Fig. 3I）。此外管型培养的HUVECs中特异性蛋白表达高于其他培养条件，这表明管型结构更利于肾近端小管血管化发生（Fig. 3J）。 

Fig. 3 Coaxial cell-printing of 3D microfluidic RPTEC and HUVEC tubes.

研究者经一系列步骤制作出血管化的肾近端小管“芯片”（Fig. 4A），并通过硅胶管将芯片连接灌注泵（Fig. 4B）。通过细胞膜绿色荧光探针（DiO）标记RPTEC，红色荧光探针（Dil）标记HUVEC，结果发现两种细胞各自分布在芯片固定区域（Fig. 4C）。培养14天后，活死染色结果提示两种细胞均较好生长（Fig. 4D）。培养28天后，分别用AQP1及CD31/VE-钙黏蛋白标记RPTECs及HUVEC，结果提示两种细胞均分化良好（Fig. 4E）。钠-葡萄糖转运蛋白（SGLT2）标记RPTEC管提示RPTECs具有极性特征（Fig. 4F, G）。进一步通过检测相关基因的表达表明该仿生肾近端小管“芯片”相比2D培养更有利于RPTECs/HUVECs的生长、分化及成熟（Fig. 4H, J）。

Fig. 4 Prototyping of 3D vascularized renal proximal tubule-on-a-chip.

最后，研究者进行了体内实验，将仿生血管化的肾近端小管移植入裸鼠的肾包膜下（Fig. 5A, B）。4周后移植物仍能保持其结构特征（Fig. 5C）。莲藕凝集素（LTL）可标记RPTECs，微血管内皮标蛋白（MECA32）可标记本体组织血管。免疫荧光检测发现MECA32高表达的本体组织血管可包绕LTL 高表达的RPTECs移植物，使其充分血管化（Fig. 5D）。此外，在HUVECs移植区域可见CD31高表达的微血管。基于以上结果可见移植物可以很好地与本体组织相互融合，并能表达相应的功能蛋白。

Fig. 5 Renal subcapsular transplantation of tubes.

综上，研究者开发的3D仿生血管化肾近端小管具有较好的细胞相容性及组织相容性，未来可用于药物肾毒性检测、疾病模型构建以及肾组织局部缺损修复。此外，研究者的实践成果可为多种管型组织构建提供理论支持，为生物医学治疗提供新的思路。

该研究由韩国浦项科技大学Dong-Woo Cho教授及天主教大学的Yong Kyun Kim教授团队合作完成，于2020年2月发表于Biomaterials。

论文信息：

Narendra K. Singh, Wonil Han, Sun Ah Nam, Jin Won Kim, Jae Yun Kim, Yong Kyun Kim^∗, Dong-Woo Cho^∗∗. Three-dimensional cell-printing of advanced renal tubular tissue analogue. Biomaterials 2020, 232; 119734.

供稿：张维东

审校：朱彩虹

编辑：王佳媛