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在蛋白质印迹法系列培训的第 4 课中，我们将说明如何进行荧光蛋白质印迹实验。首先，我们会介绍如何进行转换、一些优势以及 IRDye® 二抗。然后,我们将介绍荧光蛋白质印迹法的详细实验方案。最后，我们将为您展示一些疑难解答提示，帮助您解决荧光蛋白质印迹实验中遇到的问题。 概 述 4.1 转换为荧光 4.2 IRDye® 偶联二抗 4.3 荧光蛋白质印迹实验方案 4.4 荧光蛋白质印迹实验提示  4.1 >>> 转换为荧光蛋白质印迹 <<< 之前,您已经很好地掌握了传统化学发光(ECL)蛋白质印迹，现在我们为您介绍这一技术的荧光形式。荧光蛋白质印迹克服了传统 ECL 的局限，拥有多项优势。
当从 ECL 转换到荧光时,您需要牢记哪些问题？以下是我们提出的要点。 1.为达到最佳信噪比，优化一抗和二抗的浓度。通常情况下,您需要降低浓度。 2.使用自发荧光低的膜，否则在检测信噪比和条带定量时将遇到阻碍。可以使用低荧光 PVDF 膜。 3.不同封闭缓冲液对一抗的影响不同。我们建议在 TBST 中加入 5% 脱脂牛奶。 4.尽量避免任何其他物质沉淀到膜上从而产生荧光伪影——即使是钢笔痕迹也会产生自发荧光，所以请使用铅笔。 4.1. 不要使劲压膜，因为锋利的物体有时同样会留下荧光伪影！ 4.2. 处理膜时，为尽可能减少印迹上的伪影和指纹，请佩戴无粉丁腈手套。 5.尽管使用的大多数一抗耐光能力较强，且在正常的实验室照明下不会褪色，但为避免可能出现的光漂白现象，最好在黑暗条件下孵育膜。 6.避免洗脱肌动蛋白或 β 微管蛋白等高丰度蛋白质，因为在不影响膜其他区域总蛋白质的情况下，很难从膜上洗脱这些蛋白质。 7.最后，如果上样染料中要使用溴酚蓝，我们建议确保染料前沿移动到离待检测的蛋白质足够远的位置，因为这种染料具有自发荧光的倾向。 7.1. 您可以改变凝胶浓度，确保染料前沿已通过您的目标区域。 4.2 >>> IRDye® 偶联二抗 <<< 我们建议使用 IRDye® 偶联的二抗进行荧光蛋白质印迹实验。这项技术除了具有多重检测能力之外，IRDye® 二抗发出的信号与印迹中的靶蛋白数量成正比，可对靶蛋白进行一定程度的定量。  图 1.蛋白质印迹法 - 山羊抗兔 IgG H&L(IRDye® 800CW)预吸附二抗 (ab216773)。全部泳道：稀释度为 1/1000 的抗 NF-κB p65 抗体 (ab16502)。绿色：大小为 70 kDa 的抗 NF-κB p65 抗体(ab16502)。红色：大小为 37 kDa 的抗 GAPDH 抗体 [6C5] - 上样内参对照(ab8245)。山羊抗小鼠 IgG H&L (IRDye® 680RD) ab216776。第 1 泳道：野生型 HAP1 细胞裂解物(20 µg)。第 2 泳道：NF-κB p65 敲除 HAP1 细胞裂解物 (20 µg)。第 3 泳道：HeLa 细胞裂解物 (20 µg)。第 4 泳道：A431 细胞裂解物(20 µg)。二抗,所有泳道：稀释度为 1/10000 的山羊抗兔 IgG H&L(IRDye® 800CW) 预吸附二抗(ab216773)(山羊抗兔 IgG H&L (IRDye® 800CW)。在 MES 缓冲液系统中使用 4%-12% Bis-Tris 凝胶生产该印迹。合并信号(红色和绿色)。在 200V 下跑胶 50 分钟,然后转移到硝酸纤维素膜上,在 30V 条件下跑胶 70 分钟。然后将膜封闭一小时,之后在 4°C 的 ab16502 中孵育过夜。使用室温下孵育 1 小时、稀释度为 1/10,000 的山羊抗兔 IgG H&L(IRDye® 800CW)预吸附二抗(ab216773)检测抗体结合,然后使用 Licor Odyssey CLx 进行成像。 👉 了解关于 IRDye® 偶联二抗优点的更多信息。 4.3 >>> 荧光蛋白质印迹法实验方案 <<< 现在您已经充分了解了荧光蛋白质印迹以及由 ECL 转换时的注意事项,您可以在此查找完整荧光蛋白质印迹实验方案。 荧光蛋白质印迹实验方案包括获得荧光蛋白质印迹清晰条带所需的封闭、抗体稀释、孵育时间、清洗步骤与成像。包括从开始到结束的完整步骤。  图 2.用 Optiblot 荧光蛋白质印迹试剂盒(ab133410)同时检测 EGFR 和磷酸化 EGFR。检测出 EGF 导致 EGFR 磷酸化程度的增加。将 A431 细胞裂解物(第 1 泳道)与经过 EGF 处理的 A431 细胞裂解物(第 2 泳道)杂交,绿色通道(b)中检出 EGFR 或红色通道(c)中检出磷酸化 EGFR。两个通道在(a)中叠加。第 3 泳道：分子量标记物。 👉 点击此处,查看全部实验方案 4.4 >>> 荧光蛋白质印迹法实验提示 <<< 蛋白质印迹实验方案的全部步骤已介绍完毕,现在您可能发现您的实验需要做一些调整或进行疑难解答。如仍有困难或任何不确定的问题,您可以在我们的蛋白质印迹提示和技巧列表中查找。 👉 查看我们的荧光蛋白质印迹法实验提示。 小 结 您应该已对进行蛋白质印迹实验做好了准备。现在您需要进一步了解。 ✔ 荧光检测相对于 ECL 的优势 ✔ IRDye® 偶联二抗 ✔ 如何进行蛋白质印迹实验 ✔ 何处可以找到能帮助您获得出色实验结果的提示和技巧 |
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