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高通量测序(high-throughput sequencing)并不是指一般意义上通量高的测序，而是特指二代测序(next generation sequencing，NGS)。NGS也翻译成下一代测序、新一代测序、平行测序。NGS一次反应能同时对数百亿个核酸分子进行测序（cluster密度高达数M/mm2），虽然测序长度（读长）比一代测序短，但是模板分子数（=平行进行的测序反应数）的增加幅度惊人，所以测序通量比一代测序提高了数千万倍，测序成本的降低速度超越摩尔定律。由于数据量大规模提高，NGS使得对一个物种进行基因组分析和转录组分析成为现实；由于成本大规模降低，NGS使得临床和消费者基因检测应用变成了现实。二代测序 150-300 100M-20G 100M-6T 60Mde novo测序也叫从头测序，指一个物种第一次开展全基因组测序，其NGS数据的生物信息学数据分析由于没有现成的基因组参考序列(reference sequence)可用，算法比较特殊，难度也比较大。通常会组合运用多种测序方式，比如NGS，转录组测序（提供RNA剪接与可变转录本等信息），三代测序（长读长）等技术，数据相互参照，以取得高质量的组装图，因此成本也比较高。de novo测序的化学反应与标准NGS测序一样；但是其生物信息学数据分析算法不同，全基因组序列组装过程中不使用基因组参考序列，运算耗时较长。随着NGS技术的发展，基因组测序所需成本和时间较传统技术大幅降低，越来越多的物种获得了全基因组序列。有了基因组参考序列后，对于同一物种其他个体的测序，其生物信息学数据分析就变得相对简单了，此种测序称为重测序。重测序是对曾经进行过WGS测序、数据库中具有reference sequence的物种的不同个体进行测序。这种测序的化学反应部分与标准的NGS一样，但是生物信息学数据分析比de novo测序简单，依赖reference sequence进行全基因组组装，运算简单，速度快。重测序可以应用于个体水平或群体水平的全基因组差异分析，解析与疾病、家系遗传、癌症发生、药效等有关的基因变异，研究其致病机理，寻找新的药物作用靶点，开发新药，筛选靶向药适用人群等。随着基因组测序成本的不断降低，人类疾病的致病突变研究由外显子区扩大到了全基因组范围，实现了在全基因组水平检测疾病关联的常见、低频甚至罕见的变异，具有重大的科研和产业价值。什么是全基因组测序（whole genome sequencing, WGS）？就是对整个基因组进行NGS测序，测序区域包括外显子、内含子以及基因之间区域，测序类型包括de novo sequencing和re-sequencing。WGS文库构建流程是所有NGS应用中最简单也是最基本的，其他技术方法都是在此基础上衍生发展出来的。什么是外显子组测序（whole exome sequencing, WES）？只对某一个基因组的全部外显子区域进行NGS测序，测序区域只包括外显子，有时还包括少量UTR区域，但是不包括内含子、不包括基因之间区域。这是因为有临床意义的基因变异主要发生在外显子区域，而外显子组只占基因组的2%左右，WES可以比WGS大幅度降低测序费用。【云】WES文库的构建流程比WGS几乎复杂一倍。WES测序首先也要构建WGS文库，然后利用针对外显子区域的大量长探针进行大规模杂交，从WGS文库中把外显子片段捕获下来，再通过PCR进行扩增。Southern杂交的探针长度21 bp，而外显子捕获的探针可以长达120 bp，这是因为长探针比短探针具备更好的容错性，可以兼容各种未知的基因变异，从而在外显子文库中保留更多的基因变异信息。靶基因区域比外显子组更小的靶向测序称为panel测序。Panel测序的基因数量可变，根据研究目的可多可少，少到1个基因，多到几千个基因。其中包括所有临床验证过的遗传病致病基因的panel，称为临床全外显子组测序(clinical exome sequencing, CES)。Panel测序与外显子组测序统称靶向测序。靶向测序都有一个靶基因捕获与富集的过程。捕获富集的方法主要有两种：探针杂交和多重PCR扩增。技术 靶区域大小 建库时间 数据量 测序深度 成本WES外显子组 60M，小50倍 2.5天 10G 150x 低什么是转录组测序（transcriptome sequencing，RNA-seq）？转录组（transcriptome）指特定组织部位的细胞群、在特定时间点（即某一功能状态下）转录的全体RNA（包括mRNA和非编码RNA）的种类与拷贝数。研究人员仅需要一次试验，即可快速生成带poly-A尾巴的RNA的完整序列信息，分析基因表达、等位基因特异性表达、发现新的剪接异构体和罕见转录等转录组相关信息。【云】转录组的内容主要体现在基因表达图式上，所以转录组与基因表达基本就是同义词。基因组主要体现在基因变异（包括多态性和突变）上，所以基因组与基因序列大致就是同义词。与基因组相比，转录组的最大特色是：基因表达具有时间特异性和空间特异性。对于不同的组织样本，转录组不一样；即使是同一组织，它在不同的发育阶段和/或不同的生理状态下，其转录组也不一样。如果要研究RNA，样本种类多，不能互相取代。基因组就单纯多了，基本上全身一样、终生不变。除了肿瘤体细胞变异具有时间和空间特异性之外，基本上终生不变；除了生殖细胞是单倍体以外，基本上全身一样。这是因为基因自发发生变异的频率很低；所发生的变异当中，很大一部分又被机体自身修复了。如果研究基因组，不同类型的样本可用互相取代。除了癌组织与癌旁组织要严格区分，不可替代之外，研究遗传病的时候，外周血、唾液和新鲜冷冻组织等样本可以任取一种，其检测结果是基本一样的。你没有看错，小RNA (small RNA)就是指长度短、分子量小的RNA。小RNA种类繁多，比较常见的包括micro RNA (miRNA)、siRNA和piRNA等，它们调控基因表达、新陈代谢、细胞生长、个体发育、疾病发生等生理过程。在各种小RNA中，lncRNA和miRNA是比较有特色的两种，备受重视。成熟的miRNA是长17~24 nt的单链非编码RNA，它通过与mRNA相互作用，影响目标mRNA的稳定性及翻译，最终诱导基因沉默或者被降解。lncRNA（long noncoding RNA，长链非编码RNA）虽然号称长链，也属于小RNA，因为它只是相对于其他小RNA来说才比较长，与mRNA相比一点也不长。小RNA测序指对特定细胞、组织、或者体液样本中的全部small RNA进行深度测序并进行定量分析。由于小RNA长度短，只需要进行1x50 bp的单端(single read)测序就足够了，可以节省成本。small RNA测序有两种策略。一是先将长度在18-30 nt范围的small RNA从总RNA中分离出来，体外反转录成cDNA，然后在其两端加上通用接头，PCR扩增后测序。一是不分离small RNA，先加5’-接头，再加3’-接头，利用特别的酶的特性，只在天然带有3’-OH的小RNA的末端加接头，而人工打断的mRNA碎片不接，从而把小RNA与mRNA区分开。lncRNA测序也有两种策略。一是进行转录组测序，然后在数据分析过程中通过生物信息学的手段过滤去除mRNA数据，剩下的就是lncRNA数据。一是先用ribo-zero试剂去除样本中的rRNA，然后进行文库构建。由于rRNA占RNA样本的90%多，去除rRNA可以节省测序成本。对small RNA进行大规模测序，可以获得物种全基因组水平的miRNA图谱，实现未知miRNA分子的挖掘、小RNA作用靶基因的预测与鉴定、样品间miRNA表达差异分析、miRNA聚类和表达谱分析等目标。基于NGS的miRNA测序，一次实验即可获得数百万条miRNA序列，能够快速鉴定不同组织、不同发育阶段、不同疾病状态下已知和未知的miRNA的种类及其表达差异，为研究miRNA对细胞进程的作用及其生物学影响提供了有力的工具。宏基因组学(metagenomics)又称元基因组学、环境基因组学、生态基因组学，研究样本中的整个微生物群落，以直接从环境样本中提取的基因组遗传物质（即混合DNA）为样本，而无需进行细菌或其他微生物的分离、培养。相对于传统的单个细菌研究来说，它具有众多优势，其中最主要的有两点：(1) 微生物通常以群落方式共生于某一小生境中，它们的很多特性是基于整个群落环境及个体间的相互影响的，因此研究metagenomics比单个个体更能发现其特性；(2) Metagenomics研究无需分离单个细菌，可以研究那些不能被实验室分离培养的微生物。【云】宏基因组测序神似鸟枪法。鸟枪法不用分离、克隆靶基因，宏基因组测序不用分离、培养目标微生物。二者都能提高工作效率。与单一样本检测相比，混合样本的检测要求技术方法、试剂盒的灵敏度更高。NGS可用做宏基因组测序，一代测序和PCR就不行，正如NGS可以做NIPT，一代测序和PCR就不行一样。混合样本检测可用提高效率，节省成本，那是以先进技术为代价的。没有金刚钻，混样需慎重！
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