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上期（驾驭基因表达调控（2）如何提高兴趣基因的表达水平？）说到提高宿主特定基因拷贝数的方法有直接和间接两种。 直接方法很好理解，通过载体外源转入目的基因编码序列和必须的基因表达调控元件（启动子等）就能实现。 然而生物体本身就具有非常丰富的基因表达调控手段，很多都是针对非编码区实现的。既然非编码区可以影响基因表达水平。我们可不可以模拟这个过程间接调控基因表达？ 这个设想的实现最基本需要解决两个问题：基因在基因组的定位和激活。 定位问题 2007 年已经在 CRISPR/Cas9 系统中实现。该系统通过 gRNA 介导 Cas9（Cas9 蛋白是一种可以在gRNA介导下进行双联切割的核酸内切酶。）定位到基因组特定位点，达到极其精确的定点编辑效果。 借助基因组中名为前间区序列邻近基序（protospacer adjacent motif ，PAM)，的 DNA 碱基序列模式，CRISPR/Cas9 系统几乎可以定位到任意基因组区域。 到 2013 年，基于 dCas9 的 CRISPR interference (CRISPRi) 技术成功实现可逆的基因表达抑制，避免了 CRISPR/Cas9 对核酸序列的切割。 dCas9 是一种失去核酸剪切能力的 Cas9 蛋白变体。将负责 DNA 双链剪切的两个核酸酶活性域 RuvC1和 NHH 突变后，dCas9 可以在保留 gRNA 结合能力的情况下，定向结合到特定基因位点。 研究发现，这种结合可以阻碍转录酶对 DNA 正常转录，影响相关基因的转录水平。因此，dCas9 提供了一种在不引入碱基缺失的情况下，可逆抑制基因表达的手段。这是 CRISPRi 技术的理论基础。有了基因的‘锚’，还需要启动基因转录的‘点火器’。长期研究已经发现，转录因子结合 DNA 转录调节区后，能够引发相关基因转录激活和抑制。这种转录调控和转录因子种类、浓度密切相关。因此如果已知基因的转录激活域和相关转录激活因子，我们是不是可以通过定向‘输送’转录激活因子，提高基因表达水平？一项 2013 年的研究通过融合表达转录激活因子 VP64 和 dCas9（dCas9-VP64），在 gRNA 介导下成功实现人源细胞中特定基因转录激活。dCas9-VP64 由 dCas9 蛋白 C 端融合 VP64 蛋白激活域构成。这种蛋白可在 gRNA 介导下结合到基因启动子区，并通过 VP64 激活区域与 PolII 结合，激活基因的转录。目前已广泛应用于商业化的基因转录激活工具。然而这种技术对于基因表达水平提高效力有限，难以适应基因大量表达需求。研究发现，将多种转录因子结合单一启动子时能显著提高基因表达。2015年的一项研究通过理性设计开发出的 dCas9-VPR 系统进一步提高了基因转录水平。dCas9-VPR 是在 dCas9-VP64 基础上开发出的升级版。dCas9-VPR 的 C 端除了融合 VP64 外，还进一步融合了 p65、Rta 两个转录激活相关域。p65 是 NF-κB 顺式激活亚基，可以募集 AP-1，ATF/CREB 和 SP1 等转录因子和染色质重塑复合物（chromatin remodeling complexes）。p65 结合 P64 募集的类似转录调控蛋白如 PC4，CBP/p300 和 SWI/SNF 复合体，dCas9-VPR 可以在特定基因区域募集种类丰富的转录调控蛋白。这样的设计增加了单位基因区域转录因子募集的种类和数量，将基因转录效率在 dCas9-VP64 的基础上又提高了数十倍。同样的框架下，我们除了在蛋白上改进，如在 Cas 蛋白上融合其他基因表达调控因子，也可以在 gRNA 结构上做文章，相关例子有在 gRNA 基础上增加额外蛋白结合域的 RNA骨架（RNA scaffold, scRNA）。scRNA 增强基因表达的原理和 dCas9-VPR 类似，都是增加 DNA 序列周围转录激活相关蛋白浓度，提高基因转录水平。和 gRNA 一样，scRNA 是一种可以人工合成的具有茎环结构的 RNA。经典的 scRNA 一般包含 Cas 蛋白结合域、DNA 识别域和效应蛋白结合域。当效应蛋白结合域编码转录因子时，scRNA 就能够在特定 DNA 区域募集转录因子或相关亚基，提高该区域基因的转录效率。很多研究已经探索构建了可以募集多种效应蛋白，如 MS2、SHF1、TAL 等，的 scRNA 并评估了其转录激活效率。转录激活调控工具近年来的开发如火如荼，有小伙伴可能有疑问，既然我们已经有了基于外源 cDNA 导入的基于过表达手段，为什么还要‘费劲’开发基因表达水平有时甚至更低的转录激活工具？目前基于直接外源基因 cDNA 文库的基因获得功能研究（gain-of-function ，GOF）仍有很大局限。首先，基因转录本众多，覆盖全转录本的 cDNA 文库构建费时费力，成本高企。其次，一些大 cDNA 序列即使能合成出来也难以有效整合到常用的病毒载体中。最后，相比外源基因拷贝数增加，内源转录激活不但可以更好模拟体内基因调控的自然状态，还可以避免外源基因的干扰。一些整合型病毒载体随机整合的特性，可能会给宿主基因组造成潜在影响。讲完转录激活，我们基本介绍完了目前商业化比较成熟的提高基因表达水平的工具和技术原理。一个新问题也浮现出来，如果我们也想降低基因的表达水平，该怎么办呢？下个专题咱们再接着讲讲基因调控的另一个方向——基因沉默。Qi L S, Larson M H, Gilbert L A, et al. Repurposing CRISPR as an RNA-guided platform for sequence-specific control of gene expression[J]. Cell, 2013, 152(5): 1173-1183. Maeder M L, Linder S J, Cascio V M, et al. CRISPR RNA–guided activation of endogenous human genes[J]. Nature methods, 2013, 10(10): 977-979. Chavez A, Scheiman J, Vora S, et al. Highly efficient Cas9-mediated transcriptional programming[J]. Nature methods, 2015, 12(4): 326-328. Zalatan J G, Lee M E, Almeida R, et al. Engineering complex synthetic transcriptional programs with CRISPR RNA scaffolds[J]. Cell, 2015, 160(1-2): 339-350. Konermann S, Brigham M D, Trevino A E, et al. Genome-scale transcriptional activation by an engineered CRISPR-Cas9 complex[J]. Nature, 2015, 517(7536): 583. Tanenbaum M E, Gilbert L A, Qi L S, et al. A protein-tagging system for signal amplification in gene expression and fluorescence imaging[J]. Cell, 2014, 159(3): 635-646.
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